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前言

 

聯(lián)合用藥是指兩種或兩種以上的藥物同時或先后聯(lián)用，以增強療效或降低毒性。臨床前藥代動力學實驗中，通過動物體內(nèi)聯(lián)合給藥的方式，改變相關代謝酶或者轉運蛋白的活性，進而影響同服藥物的機體內(nèi)處置，在此過程中橋接體外和臨床藥代動力學相互作用研究。另一方面，基于藥物相互作用的聯(lián)合用藥可以研究同服藥物的體內(nèi)處置機制，有助于同服藥物的前期優(yōu)化，從而得到新一代的藥物。本篇文章就臨床前藥代動力學實驗中常用的聯(lián)合給藥及其實驗設計進行總結并舉例說明。

 

1、與轉運體抑制劑進行聯(lián)合給藥

 

藥物轉運體是一類位于細胞膜上的具有轉運功能的蛋白質(zhì)，廣泛分布于機體內(nèi)的各個組織，在藥物的體內(nèi)處置過程中發(fā)揮了重要作用。藥物轉運體包含兩個不同的超家族，ABC轉運蛋白（ATP-binding cassette transporters）主要為外排轉運體，溶質(zhì)轉運體（solute carrier，SLC transporters）既有外排轉運體也有攝取轉運體。在不同的臨床前動物種屬中，轉運體的表達水平，可能存在種屬差異。如表1所示，P-糖蛋白（P-gp）和有機陰離子轉運多肽（OATP1B1/1B3）在不同動物種屬中表現(xiàn)出差異[1]。以下以P-gp和OATP1B1/1B3抑制劑聯(lián)合給藥為例展開討論。

 

表1. P-gp、OATP1B1/1B3轉運體在不同動物種屬中的基因名稱和mRNA表達水平

 

1、與P-gp抑制劑進行聯(lián)合給藥

 

P-糖蛋白（P-glycoprotein，P-gp）屬于ABC轉運蛋白家族，通過ATP水解獲得能量把底物泵出細胞膜。該蛋白表達于多種膜屏障中，包括血腦屏障、胃腸道、肝、卵巢和胎盤等。P-gp的底物范圍廣泛，能夠識別與轉運一系列結構多樣的內(nèi)源性和外源性物質(zhì)，包括多種化療藥物。腸道P-gp阻礙口服底物的吸收，降低其生物利用度。這種影響可通過聯(lián)合使用P-gp抑制劑來降低或消除，從而促進底物的吸收，增加血藥濃度。體外試驗可選擇的P-gp轉運體抑制劑見表2。

 

表2. 體外試驗可選擇的P-gp轉運體抑制劑[2]

體外測試中，常用唑喹達與Caco2或MDCK-MDR1細胞共孵育來抑制P-gp的轉運作用。通過待測化合物在加與不加唑喹達的情況下外排的差異來判斷其是否為P-gp的底物。臨床前動物體內(nèi)PK實驗中，依克立達聯(lián)合用藥最為常見，一般提前口服灌胃，嚙齒類動物給藥劑量常見30-100 mg/kg，犬和猴子給藥劑量約30 mg/kg。恩喹達（encequidar）也用于抑制不同的動物種屬的體內(nèi)P-gp活性，給藥劑量與依克立達相比偏低，約10-50 mg/kg。

 

依克立達或恩喹達的聯(lián)合給藥在臨床上也有應用。經(jīng)典的案例是與紫杉醇類藥物的聯(lián)合用藥來開發(fā)口服紫杉醇類藥物。由于紫杉醇類藥物的水溶性差且是P-gp外排的底物，口服給藥嚴重阻礙其腸道吸收，臨床上只能靜脈給藥。紫杉醇類藥物與依克立達[3]或恩喹達[4]的聯(lián)合口服可增加紫杉醇類藥物的血漿濃度，使得口服紫杉醇類藥物成為可能。

 

中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療藥物需要進入大腦發(fā)揮作用，但血腦屏障（blood-brain barrier，BBB）的存在限制了藥物的通過，P-gp在BBB中高度表達，是許多藥物不能進入大腦的原因。如何克服BBB上外排轉運體如P-gp的外排，成為中樞神經(jīng)系統(tǒng)藥物治療的瓶頸。在研發(fā)早期階段，為了驗證中樞神經(jīng)系統(tǒng)藥物的藥效，通常使用P-gp基因敲除的動物開展藥效實驗，這為臨床前藥效實驗的開展提高了難度和成本。而使用野生型動物與P-gp抑制劑聯(lián)合用藥不失為一個有效途徑。拉帕替尼是一種人表皮受體2（HER2）和EGFR的小分子酪氨酸激酶抑制劑，目前已被批準用于治療HER2陽性的晚期和轉移性乳腺癌。P-gp和乳腺癌抗性蛋白（BCRP）嚴重影響了拉帕替尼的腦滲透作用。在大鼠中將其與依克立達聯(lián)用后，依克立達顯著增加了拉帕替尼在腦脊液和腦組織中的滲透（Cmax分別增加136.4%和54.7%，AUC分別增加53.7%和86.5%）[5]。

 

2、與OATP1B1/1B3抑制劑聯(lián)合給藥

 

有機陰離子轉運多肽（organic anion transporting polypeptides，OATPs）屬于溶質(zhì)轉運體家族，主要在肝、腎和小腸中表達，調(diào)節(jié)許多內(nèi)源性和外源性化合物的組織攝取。其中OATP1B1和OATP1B3主要分布于肝細胞基底側，在許多藥物肝攝取過程中發(fā)揮重要作用，包括臨床常用藥物如羥甲基戊二酰輔酶A還原酶的抑制劑（他汀類）、血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑（沙坦類）、血管緊張肽轉換酶抑制劑和抗糖尿病類藥物（列奈類）等均是OATP1B1和OATP1B3轉運體的底物。對于主要經(jīng)肝代謝的藥物，肝攝取轉運體介導轉運活性的抑制會改變其血藥濃度，繼而可能增加毒副作用。十九世紀末發(fā)生西立伐他汀與吉非貝齊聯(lián)用，導致多人死亡，也最終導致西立伐他汀退市[6]，一些臨床實驗可選擇的OATP1B1/1B3轉運體抑制劑見表3。

 

體外實驗中，待測藥物在HEK293-MOCK細胞和OATP1B1轉染的HEK293細胞中孵育時，通過加或不加環(huán)孢素A（OATP1B1抑制劑），檢測待測藥物攝取的差異，以評價待測藥物是否是OATP1B1的底物。OATP1B3的底物評價流程與此類似。

 

若明確目標藥物為OATP1B1/1B3底物，則可選用合適的OATP1B1/1B3抑制劑進行動物體內(nèi)聯(lián)用給藥，考察藥物在OATP1B1/1B3轉運體被抑制后體內(nèi)的暴露情況。由于嚙齒類動物中無人的OATP1B1/1B3同源相關基因，需要使用人OATP1B1/1B3轉基因的嚙齒動物開展實驗[7]。食蟹猴的OATP1B1/1B3氨基酸序列與人的序列相似度分別為91.9%和93.5%。體外攝取實驗表明食蟹猴的OATP1B1/1B3和人的表現(xiàn)出相似的底物攝取速率，體外抑制試驗中六種已知的人的OATP1B1/1B3抑制劑對食蟹猴的OATP1B1/1B3也表現(xiàn)出相似的IC50值。在體內(nèi)PK實驗中，利福平聯(lián)合阿伐他?。∣ATP1B1/1B3底物）給藥后食蟹猴體內(nèi)阿伐他汀暴露量改變情況與人體聯(lián)合給藥后情況相似。這些實驗無不表明食蟹猴是臨床前評價OATP1B1/1B3介導的藥物相互作用的良好模型[8]。臨床前體內(nèi)聯(lián)合給藥實驗設計見表4所示。

 

表3. 臨床實驗可選擇的OATP1B1/1B3轉運體抑制劑[2]

表4. OATP1B1/1B3介導的藥物相互作用臨床前PK實驗設計[7-8]

 

 

 

2、與代謝酶抑制劑進行聯(lián)合給藥

 

藥物吸收到體內(nèi)后會被藥物代謝酶代謝，發(fā)生I相代謝如氧化、還原、水解反應，以及II相代謝如葡萄糖醛酸結合、谷胱甘肽結合和氨基酸結合等。細胞色素酶P450（CYP450）是主要的藥物代謝酶系，其中CYP3A4是最重要的一個亞家族，具有廣泛的底物特異性，其參與了超過50%的上市小分子藥物的代謝過程，占肝臟CYP酶總量的30%[9-10]。抑制相應的代謝酶會降低酶的活性，降低藥物的代謝速度，從而提高血漿藥物濃度，增強藥效。酶誘導劑會增加酶的活性，藥物的代謝速度加快，會降低血漿中的藥物濃度，從而降低藥效。

 

不同種屬間CYP450酶一級結構的氨基酸序列微小差異導致了較大的底物特異性和催化活性的差別，從而造成藥物代謝的差異（表5）[11]。據(jù)報道，犬的CYP2D活性與人最相似，猴的CYP2C與人最接近，小鼠的CYP1A與人較接近，小鼠和雄性大鼠的CYP3A活性與人最接近[12-13]。

 

表5. CYP酶家族在不同動物種屬中的差異[11]

*性別差異；#品系差異

 

1、與CYP450酶抑制劑聯(lián)合給藥

 

氨基苯并三唑（1-aminobenzotriazole，簡稱1-ABT或ABT）是非特異且不可逆的CYP450酶抑制劑，因此對CYP450各個亞型的抑制時間持續(xù)較長，可以和經(jīng)CYP450酶代謝的藥物聯(lián)用，以降低或避免CYP450的代謝。一些臨床試驗可選擇的CYP特異性抑制劑如表6所示。

 

表6. 臨床試驗可選擇的CYP特異性抑制劑[2]

 

在體外實驗中，可以在孵育體系中（肝微粒體、重組酶等），在加和不加ABT的情況下預先孵育30分鐘，比較代謝情況，以評估ABT對CYP酶的影響[14]。動物體內(nèi)實驗中，給予一定劑量的ABT后，也能起到抑制CYP450酶活性的作用。ABT適應用不同的動物種屬，一般提前2小時灌胃給藥，嚙齒類動物的給藥劑量約為50-100 mg/kg。犬的給藥劑量約20 mg/kg，猴的給藥劑量約100 mg/kg[14]。約5-50 mg/kg的利托那韋可抑制嚙齒類動物的體內(nèi)CYP450酶活性。約30 mg/kg的考比司他（cobicistat）可抑制犬和猴的體內(nèi)CYP450酶活性。

 

利托那韋和考比司他已經(jīng)在臨床上使用。例如，治療新冠的復方制劑帕羅韋德（paxlovid）中，利托那韋作為奈瑪特韋（nirmatrelvir）的藥效增強劑，治療HIV感染的考阿扎那韋（atazanavir）或地瑞那韋（darunavir），聯(lián)用考比司他以抑制CYP3A代謝。

 

2、與CYP450酶誘導劑聯(lián)合給藥

 

人類的CYP1A1、CYP1A2、CYP2B6、CYP2C8、CYP2C9、CYP2C19和CYP3A4酶是可誘導的，而CYP2D6不可被誘導[11]。酶誘導的發(fā)生是由于轉錄激活導致mRNA水平升高隨后蛋白表達增加，核受體（PXR、CAR、GPCR等）介導CYP3A和CYP2B的轉錄活化，芳香烴受體（AhR）介導CYP1A的轉錄活化。與以上機理不一樣的是CYP2E1，其通過穩(wěn)定蛋白質(zhì)的方式產(chǎn)生誘導。臨床實驗可選擇的CYP酶誘導劑見表7。

 

由于酶誘導需要蛋白合成，往往需要幾天時間。臨床前動物PK實驗中，需要連續(xù)每天給一定劑量的誘導劑，如需要連續(xù)6天給予一定劑量的利福平后才會在猴體內(nèi)產(chǎn)生CYP酶的誘導。

 

另外需要注意的是，大鼠的CYP3A1（大鼠肝臟中主要的CYP3A形式）不能被人CYP3A誘導劑利福平所誘導，因此大鼠不適合于臨床前CYP3A的誘導實驗研究[11]。

 

表7. 臨床試驗可選擇的CYP酶誘導劑[2]

 

3、與酰胺水解酶抑制劑聯(lián)合給藥

 

酰胺鍵廣泛存在于藥物結構中，其易受酰胺水解酶代謝而發(fā)生斷裂，如圖1所示。一些常見的酰胺水解酶包括羧酸酯酶（carboxylesterase，CES）、丁酰膽堿酯酶（butyrlcholinesterase，BChE）、芳乙酰胺脫乙酰酶（arylacetamide deacetylase，AADAC）、醛氧化酶（aldehyde oxidase, AO）等。其相應的常見酶抑制劑見表8。

 

不同動物種屬在藥物代謝酶的同工型組成、表達和催化活性方面的不同，對于化合物的代謝可能會造成巨大差異。人類的CES酶主要有6個亞型，其中人體中最常見的為CES1（主要分布在肝臟和肺）和CES2（主要分布在小腸和腎臟）。在人、犬和猴子的血漿中缺乏CES酶，但小鼠和大鼠血液中CES酶含量較高[19]。因此CES酶底物在小鼠和大鼠血漿中很不穩(wěn)定，而在大動物或人的血漿中不存在這個問題，表現(xiàn)出明顯的種屬差異。嚙齒動物的PK實驗中，提前0.5小時給予一定劑量的BNPP后，由于BNPP是CES酶的不可逆抑制劑，起效后對CES酶的抑制時間較長，能明顯降低CES酶的體內(nèi)代謝。

 

圖1. 含酰胺鍵藥物在大鼠或小鼠血漿中的穩(wěn)定性

 

表8. 常見的酰胺水解酶抑制劑

 

4、與GST酶抑制劑聯(lián)合給藥

 

谷胱甘肽S-轉移酶是自然界中一類最重要的解毒酶之一，其催化谷胱甘肽（GSH）和各種內(nèi)源性和外源性底物的結合，以降低底物的活性和增加其溶解度。根據(jù)GST酶在細胞中的位置，GST酶可分為三大類：胞質(zhì)GST酶、線粒體GST酶和微粒體GST酶。

 

胞質(zhì)GST酶可以進一步細分為7類，包括alpha、mu（GST-M）、pi、theta（GST-T）、zeta、omega和sigma類[20]，他們具有不同但重疊的底物特異性。人類和嚙齒動物之間的谷胱甘肽結合存在顯著種屬差異和性別差異。如小鼠的總胞質(zhì)GST酶、GST-M、GST-T和微粒體GST酶活性明顯高于人類，大鼠的GST- M和GST-T活性明顯高于人類。雄性大鼠的GST-M和GST-T活性比雌性大鼠更高。因此，如果GST酶介導的代謝是主要代謝途徑，臨床前研究中動物種屬的選擇也很關鍵[21]。

 

依他尼酸（ethacrynic acid，EA，又稱“利尿酸”）是FDA批準的利尿劑（結構見圖2），其也是一種有效的通過共價起效但可逆的GST酶抑制劑[22]。其他的GST酶抑制劑還包括阿魏酸松柏酯（coniferyl ferulate，CF）[23]等。

 

體外實驗中，為了抑制GST介導的GSH結合反應，如在肝細胞或胞質(zhì)中孵育時可以加入一定濃度的依他尼酸[24]。體內(nèi)實驗中EA聯(lián)合給藥的實驗設計如表9所示[24]。

 

圖2. 依他尼酸和阿魏酸松柏酯結構

 

表9. GST酶抑制劑EA聯(lián)合給藥臨床前PK實驗設計[24]

 

 結語 

 

總體而言，在臨床前藥代動力學實驗中聯(lián)合給藥時，需要同時考慮到藥物發(fā)揮作用的機制、起效部位和起效時間等，從而設計聯(lián)合使用的兩個藥物的劑量、給藥方式和給藥間隔，以達到預期的實驗結果。

 

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