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Ni-NTA是鎳柱純化常用的一種填料，鎳柱純化常指親和層析，該方法利用組氨酸（His）殘基上的咪唑基團(tuán)與Ni2+之間能形成配位鍵的特性，實(shí)現(xiàn)對含有His-Tag（組氨酸標(biāo)簽）的目的蛋白的特異性吸附。

His-Tag是重組蛋白純化中最常見的標(biāo)簽之一，其通過融合表達(dá)與目的蛋白相連，從而賦予目的蛋白與鎳柱結(jié)合的能力。在層析過程中，雜蛋白因不帶有His殘基無法與Ni2+結(jié)合，從而實(shí)現(xiàn)了目的蛋白與非目的蛋白的有效分離。

操作步驟

① 準(zhǔn)備工作：

（1）根據(jù)目的蛋白的性質(zhì)，選擇合適的鎳柱類型和洗脫方式，配制合適PH值的緩沖液和洗脫液。

（2）緩沖液和洗脫液在蛋白純化操作前用0.45 μm或0.22 μm濾頭過濾除菌避免污染鎳柱，減少壽命。

② 樣品預(yù)處理：

預(yù)處理待純化的蛋白樣品，如離心去除雜質(zhì)、調(diào)整樣品的pH值、低濃度咪唑溶液透析以去除培養(yǎng)基中的EDTA和鹽溶液等（具體操作需根據(jù)蛋白性質(zhì)設(shè)計(jì)）。

③ 鎳柱平衡及上樣：

利用無咪唑或低濃度咪唑的緩沖液對鎳柱進(jìn)行平衡，待曲線維穩(wěn)10 min左右，即平衡結(jié)束。平衡完成后，將處理完畢的樣品緩慢且勻速地加入鎳柱中，使目的蛋白與鎳柱充分結(jié)合。

④ 除雜：

使用低濃度咪唑緩沖液（如2、5 、10、20、25 mM咪唑）沖洗鎳柱，去除與鎳柱非特異性結(jié)合的雜蛋白。該過程應(yīng)合理控制流速和時(shí)間，以確保雜蛋白被完全去除。

⑤ 洗脫：

為收集高純度的目的蛋白，使用含有高濃度咪唑的洗脫液將目的蛋白從鎳柱上洗脫下來。通過梯度洗脫的方式，逐步增加洗脫液中咪唑的濃度（如50、100、200、300、400、500 mM咪唑）。在目的蛋白首次純化實(shí)驗(yàn)中，應(yīng)設(shè)置多個(gè)從低至高咪唑濃度的緩沖液，探索合適的洗脫條件。

⑥ 收集與分析：

收集含目的蛋白的洗脫液樣品，利用SDS-PAGE電泳等方法對其進(jìn)行分析以評估其純度和濃度。

⑦ 清洗與保存：

使用ddH2O沖洗鎳柱，并用20%乙醇溶液沖洗并保存鎳柱以防止微生物生長。

注意事項(xiàng)

① 在實(shí)驗(yàn)前查詢并了解目的蛋白的性質(zhì)（分子量、等電點(diǎn)、氨基酸組成、聚體等），并嚴(yán)格控制實(shí)驗(yàn)條件，如緩沖液的pH值和咪唑濃度，以確保實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性和可重復(fù)性。

② 嚴(yán)格按照說明書操作，并且樣品在上柱前需要進(jìn)行預(yù)處理（高速離心、調(diào)PH或透析等），以保護(hù)鎳柱，避免污染和損傷。

③ 在鎳柱的使用中，應(yīng)避免緩沖液中存在還原劑和螯合劑，以免 Ni2+ 被還原而脫落。

④ 鎳柱使用太久或脫鎳，可進(jìn)行鎳柱再生或更換新的鎳柱。

⑤ 盡量收集鎳柱純化過程中每一步產(chǎn)生的洗脫液，以便實(shí)驗(yàn)結(jié)束后利用SDS-PAGE等方法對蛋白純化過程進(jìn)行進(jìn)一步分析。