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轉(zhuǎn)化是指將質(zhì)粒DNA導(dǎo)入細菌的過程，通過熱激、冰浴、搖菌、挑菌等過程達到質(zhì)?？寺?、質(zhì)粒鑒定等目的，質(zhì)粒轉(zhuǎn)化前需準(zhǔn)備的試劑包括：感受態(tài)細胞、質(zhì)粒、無抗生素的LB液體培養(yǎng)基、氨芐抗性LB固體培養(yǎng)基平板，耗材及實驗設(shè)備包括：搖菌管、Ep管、超凈臺、涂菌棒、酒精燈、水浴鍋等。

實驗步驟:

1.提前將感受態(tài)細胞放置在冰盒上解凍，準(zhǔn)備好質(zhì)粒和相應(yīng)數(shù)量的1.5mL EP管。

2.感受態(tài)細胞解凍后取50μL加入EP管中，再加入0.5-1μL質(zhì)粒，冰浴30min。

3.水浴鍋42℃熱激60s，繼續(xù)冰浴5min。

4.在超凈臺內(nèi)加入無抗性的LB液體培養(yǎng)基500μL，搖床設(shè)置37℃速度180rpm，孵育15-30min。

5.常溫離心機設(shè)置4500rpm，離心5min。

6.離心結(jié)束后去上清530μL左右，剩余部分用移液器輕輕混勻。

7.將LB固體培養(yǎng)基平板標(biāo)記好基本信息，取上述液體約10-20μL進行涂板，涂板完成后倒置在37℃（由感受態(tài)細胞說明書決定溫度）恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)過夜。

8.第二天上午取出平板觀察菌落大小及密度，達到要求后封口膜封閉后暫存于冰箱4℃。

9.當(dāng)天下午，根據(jù)實驗要求挑取相應(yīng)數(shù)量的單克隆菌落，放入已加入氨芐抗性LB液體培養(yǎng)基3-4mL的搖菌管內(nèi)，搖床設(shè)置220-240rpm，傾斜放入搖菌管，擰松瓶蓋后培養(yǎng)過夜，時間12-16h為宜。

10.第二天上午使用試劑盒抽質(zhì)粒，不同的試劑盒操作流程各異，根據(jù)說明書步驟進行操作即可。

經(jīng)驗總結(jié):

1.感受態(tài)細胞-80℃保存，轉(zhuǎn)化開始前拿出放在冰上融化，以我的經(jīng)驗來說，感受態(tài)細胞呈渾濁液體，因此在融化的過程中，可以拿起來用輕彈管壁觀察是否完全融化。

2.在步驟4當(dāng)中，搖床孵育時間由質(zhì)粒情況決定，若是普通載體克隆，15min足夠，且第5步的離心也可省略直接涂板即可，若是重組質(zhì)粒的鑒定，則應(yīng)延長至30min。

3.培養(yǎng)基中使用哪種抗生素由質(zhì)粒決定，應(yīng)仔細閱讀說明書。

4.步驟7中，涂板的量可由自己經(jīng)驗決定，一般來說普通質(zhì)粒不離心取30μL涂板（6cm固體平板）密度適中。涂板時應(yīng)將涂菌棒完全消毒，可先在75%酒精中浸泡，再用酒精燈外焰燒15s左右，待涂菌棒完全降溫后進行涂板，若不確定是否恢復(fù)常溫，可在無菌液的空白處進行嘗試。

5.涂板完成后，培養(yǎng)時間一般過夜即可，第二天長出肉眼可見、大小適中的菌落可進行挑菌。

6.搖菌完成后，提質(zhì)粒之前若不確定搖的菌液是否合適，可在酶標(biāo)儀中測OD600的值來估算細菌濃度，若OD值在3左右，說明細菌濃度已經(jīng)達到飽和，適合提質(zhì)粒。

7.轉(zhuǎn)化開始前仔細閱讀質(zhì)粒說明書，選擇合適的感受態(tài)細胞是整個實驗成功必不可少的一環(huán)。