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蛋白提取是WB實(shí)驗(yàn)的前期工作，也是WB實(shí)驗(yàn)成功的關(guān)鍵。如何避免蛋白分解，有效地提取蛋白顯得尤其重要。以下介紹兩種全蛋白提取方法以及相關(guān)的注意事項(xiàng)：

方法1

1、細(xì)胞準(zhǔn)備：準(zhǔn)備近乎長(zhǎng)滿的細(xì)胞，此處以10cm大皿為例；

2、清洗：用預(yù)冷的PBS清洗大皿中細(xì)胞1-2次，并棄去PBS；

3、收集細(xì)胞：加入1mL PBS，用細(xì)胞刮刀刮取細(xì)胞，慢慢旋轉(zhuǎn)刮取，來(lái)回刮2-3次，不留空白，并移至EP管中，常溫1200rpm，離心5min，并棄去PBS；

4、裂解液配制：按照RIPA裂解液（強(qiáng)）：PMSF=100：1，加入400μL RIPA/皿和4μL PMSF/皿，若為磷酸化蛋白，則需加入磷酸酶抑制劑，比例為RIPA裂解液（強(qiáng)）：PMSF：磷酸酶抑制劑=100：1：1，并置于4℃；

5、裂解細(xì)胞：將上述配制好的裂解液加入步驟3 中EP管，4℃裂解15min；

6、超聲破碎：將上述裂解后的細(xì)胞用細(xì)胞超聲破碎儀破碎1-2min，功率為20-30%，保持4℃；

7、離心：超聲破碎后，4℃，12000rpm離心15min;

8、蛋白變性：吸取7中的上清液至新的EP管中，并按蛋白液：5x loading buffer=4：1，加入適量的5x loading buffer，金屬浴100℃，10min；

9、存放：將變性后的蛋白存至-80℃冰箱。

方法2

1、細(xì)胞準(zhǔn)備：準(zhǔn)備近乎長(zhǎng)滿的細(xì)胞，此處以10cm大皿為例；

2、清洗：用預(yù)冷的PBS清洗大皿中細(xì)胞1-2次，并棄去PBS；

3、裂解液配制：按照PBS：5X loading buffer =4：1配制裂解液，按照裂解液：PMSF=100：1加入PMSF，若為磷酸化蛋白，則需加入磷酸酶抑制劑，比例為裂解液：PMSF：磷酸酶抑制劑=100：1：1，并置于4℃；

4、裂解細(xì)胞：將上述配制好的裂解液加入大皿中，4℃裂解15min；

5、收集：用細(xì)胞刮刀刮取細(xì)胞，慢慢旋轉(zhuǎn)刮取，來(lái)回刮2-3次，不留空白，并移至EP管中；

6、蛋白變性：吸取7中的上清液至新的EP管中，并按蛋白液：5x loading buffer=4：1，加入適量的5x loading buffer，金屬浴100℃，10min；

7、存放：將變性后的蛋白存至-80℃冰箱。

常見(jiàn)問(wèn)題解析

1、開(kāi)始裂解至變性前，須保持4℃，以免蛋白降解；

2、加入裂解液至EP管時(shí)，可緩慢吹打混勻細(xì)胞，以裂解充分；

3、若裂解后仍然較為粘稠 ，可適當(dāng)增加裂解液；

4、蛋白常見(jiàn)的保存溫度為-20℃或-80℃。-20℃可較好地保護(hù)蛋白質(zhì)的活性和穩(wěn)定性。在這種溫度下，蛋白質(zhì)提取液可以較長(zhǎng)時(shí)間保存，一般能保持?jǐn)?shù)月至一年左右的穩(wěn)定性。-80℃蛋白質(zhì)的降解和變性速度更慢，可以更長(zhǎng)時(shí)間地保持蛋白質(zhì)的完整性和活性，可以長(zhǎng)期保持?jǐn)?shù)年至十年的穩(wěn)定性；

5、保存蛋白質(zhì)提取液時(shí)，應(yīng)避免頻繁的溫度波動(dòng)和反復(fù)凍融，這可能會(huì)對(duì)蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性產(chǎn)生影響；

6、盡量避免用胰酶消化細(xì)胞，因?yàn)橐让缚赡軙?huì)影響到需要提取的目的蛋白，尤其是膜蛋白；

7、細(xì)胞不可生長(zhǎng)過(guò)滿，否則影響細(xì)胞狀態(tài)乃至蛋白的表達(dá)。