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細(xì)胞計(jì)數(shù)在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中是非常常見的，大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室目前使用細(xì)胞計(jì)數(shù)板進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，細(xì)胞計(jì)數(shù)板的結(jié)構(gòu)如下圖所示：

實(shí)驗(yàn)步驟

1.所用細(xì)胞密度達(dá)到一定要求后進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)鋪板，提前準(zhǔn)備好細(xì)胞計(jì)數(shù)板、蓋玻片、計(jì)數(shù)器。

2.棄掉原有培養(yǎng)基，加入1ml溫浴的PBS緩沖液清洗。

3.棄掉PBS緩沖液，加入胰酶消化細(xì)胞，消化時(shí)間根據(jù)細(xì)胞類型及日常經(jīng)驗(yàn)決定。

4.消化相應(yīng)時(shí)間后，加入二倍體積的培養(yǎng)基終止消化，用移液器將細(xì)胞全部吹下，轉(zhuǎn)移至離心管內(nèi)。

5.離心機(jī)室溫800rpm，離心5min。

6.準(zhǔn)備和所計(jì)數(shù)細(xì)胞種類數(shù)相同的1.5ml Ep管，各加入PBS緩沖液980μl備用。

7.準(zhǔn)備細(xì)胞計(jì)數(shù)板，并在計(jì)數(shù)區(qū)蓋上蓋玻片。

8.將5中離心結(jié)束的細(xì)胞棄上清，加入1ml培養(yǎng)基，充分混懸后取20μl加入到6中的Ep管中，充分顛倒混勻后取12μl加入牛鮑計(jì)數(shù)板一側(cè)的計(jì)數(shù)區(qū)內(nèi)，保證計(jì)數(shù)區(qū)充盈。

9.低倍顯微鏡（物鏡4）下找到計(jì)數(shù)視野，上圖中“B C D E”區(qū)為細(xì)胞計(jì)數(shù)區(qū)。

10.高倍鏡（物鏡10）下計(jì)數(shù)細(xì)胞，依次計(jì)數(shù)4個(gè)方格內(nèi)的細(xì)胞數(shù)量。

11.計(jì)算細(xì)胞數(shù)量，假設(shè)4個(gè)方格內(nèi)細(xì)胞總數(shù)為A，則每ml的細(xì)胞數(shù)量為：A/4×104×50（稀釋倍數(shù)）=B個(gè)。

12.假設(shè)鋪板所需細(xì)胞密度為1×104個(gè)/ml，則所需8中的細(xì)胞混懸液的量為：1×104×C（培養(yǎng)基所需毫升數(shù)，如6孔板每孔加培養(yǎng)基2ml）/B=D ml，最后換算成μl即可。

13.鋪板：取C ml培養(yǎng)基，加入8中細(xì)胞混懸液D μl，充分混勻后依次加入培養(yǎng)皿中，放入細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)即可。

常見問題及注意事項(xiàng)

1.鏡下計(jì)數(shù)細(xì)胞時(shí)，壓線細(xì)胞按照“計(jì)上不計(jì)下，計(jì)左不計(jì)右”的原則進(jìn)行，若有少量成團(tuán)細(xì)胞，則按1個(gè)細(xì)胞處理，若成團(tuán)細(xì)胞太多，說明在步驟8中，細(xì)胞混懸不徹底，未能徹底分開成單細(xì)胞，因此需重新進(jìn)行上述步驟。

2.需要鋪板的細(xì)胞長(zhǎng)滿時(shí)數(shù)量較多，因此計(jì)數(shù)時(shí)稀釋倍數(shù)盡量大，取混懸液的每一步保證細(xì)胞充分混勻，計(jì)數(shù)結(jié)果更為準(zhǔn)確。

3.鏡下計(jì)數(shù)細(xì)胞時(shí)，最少計(jì)數(shù)兩次，取平均值為最終結(jié)果。

4.細(xì)胞混懸液加入細(xì)胞計(jì)數(shù)板時(shí)，建議使用10μl小槍頭、2-20μl移液器，槍頭傾斜抵住蓋玻片邊緣，緩慢加入，務(wù)必保證細(xì)胞混懸液全部加入，計(jì)數(shù)區(qū)充盈。

關(guān)于細(xì)胞計(jì)數(shù)，以如下實(shí)例來充分理解上述計(jì)算過程：

1.假設(shè)實(shí)驗(yàn)要求最后鋪板密度為1×105個(gè)/ml，計(jì)劃以6孔板鋪板，擬使用4個(gè)孔，每孔2ml培養(yǎng)基，則所需細(xì)胞總數(shù)為：1×105×2ml×5孔=1×106個(gè)。

2.假設(shè)4孔細(xì)胞總數(shù)為100個(gè)，則細(xì)胞密度為：100/4×104×50（稀釋倍數(shù)）=1.25×107個(gè)/ml。

3.最終所需細(xì)胞懸液量為：1×106/1.25×107=0.08ml=80μl

4.鋪板：培養(yǎng)基5孔（為防止不夠所以多準(zhǔn)備1孔）2ml×5孔=10ml加入細(xì)胞混懸液800μl，混勻加入六孔板即可。