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一、 寫在前面

Western Blotting（WB）作為常見的蛋白檢測(cè)手段之一，通常是絕大部分科研工作者不可避免的一項(xiàng)基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)。然而，其實(shí)驗(yàn)流程相對(duì)較為復(fù)雜，忽視任一細(xì)節(jié)均有可能導(dǎo)致整個(gè)實(shí)驗(yàn)的失敗，這也常令很多科研者苦不堪言。目的條帶不清晰而背景卻又黑又臟，甚至顯影出來只能看見黑乎乎的背景，這是WB中最為常見的問題之一，是什么原因?qū)е铝烁弑尘暗某霈F(xiàn)？面對(duì)這種情況我們?cè)撊绾谓鉀Q呢？本文就從以下幾個(gè)方面進(jìn)行詳細(xì)地介紹。

二、 常見的背景來源及解決方案

1．樣品質(zhì)量

樣品質(zhì)量是決定WB成敗的關(guān)鍵一步，絕大多數(shù)情況下我們均是以提取總蛋白作為WB的開端。而在總蛋白提取過程中不可避免會(huì)受到諸如核酸、脂類、裂解液等物質(zhì)的干擾，樣品純度受到影響自然而然會(huì)帶來高背景。此外，在我們目的蛋白表達(dá)量較低的情況下，其在總蛋白中的比例也相應(yīng)較低，不易檢測(cè)到，為優(yōu)化目的條帶，不得不做出提高抗體濃度、加大上樣量等措施，由此造成高背景。

因此，在提取總蛋白時(shí)，一方面我們需要保證盡可能地提高樣品純度，如：吸取蛋白時(shí)需小心謹(jǐn)慎，避免吸入雜質(zhì)；另一方面則要防止蛋白降解造成蛋白丟失，如：提取過程均在低溫環(huán)境中進(jìn)行、加入蛋白酶抑制劑防止蛋白降解等。

2．上樣量

上樣量對(duì)背景也有影響。如果預(yù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)蛋白濃度較低，那么下次提取時(shí)就需要適當(dāng)提高組織或細(xì)胞用量，而不可一味地加大上樣量，如下圖所示，加大上樣量時(shí)，背景也會(huì)隨之加深。

3．封閉

封閉的目的在于去除其他無關(guān)蛋白的影響，倘若封閉不完全，就會(huì)產(chǎn)生高背景。這通常也是產(chǎn)生高背景時(shí)需要優(yōu)先考慮并進(jìn)行優(yōu)化的因素，一方面可以提高封閉液的濃度，另一方面亦可延長封閉時(shí)間，以降低背景。

4．洗滌

洗滌不徹底也會(huì)導(dǎo)致一些非特異性結(jié)合的殘留，從而產(chǎn)生高背景。因此，可以通過加大洗滌液的用量、增加洗滌次數(shù)、延長洗滌時(shí)間來改善。

5．膜

一方面，需要確保我們所采用的NC膜或PVDF膜保存得當(dāng)，是干凈無污的，以免膜本身的原因影響顯影造成高背景；另一方面，在整個(gè)操作過程中要充分確保膜的濕潤，謹(jǐn)防干膜帶來高背景。

6．抗體

抗體濃度過高時(shí)也會(huì)導(dǎo)致高背景，甚至條帶反白，因此，需通過預(yù)實(shí)驗(yàn)摸索抗體濃度及孵育時(shí)間，尋求合適的抗體孵育條件。另外，抗體本身的質(zhì)量也是造成高背景的關(guān)鍵，抗體質(zhì)量有問題，要么直接無條帶，要么產(chǎn)生過多雜帶造成高背景，此時(shí)就需要考慮換抗體，當(dāng)然，由于抗體售后過于繁瑣，更換抗體也會(huì)增加實(shí)驗(yàn)成本，耽誤實(shí)驗(yàn)進(jìn)度等問題，因此，更換抗體也是我們毫無束手之策時(shí)才需要考慮的。

三、 其他實(shí)用小Tips

1．洗滌時(shí)，無論采用PBST還是TBST，Tween-20均在其中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，其能有效去除非特異性結(jié)合產(chǎn)物，降低背景，可以將其通俗的理解為去污劑，倘若背景較深時(shí)，可以適當(dāng)加大PBST或TBST中Tween-20的用量，以有效去除背景；

2．顯影后倘若發(fā)現(xiàn)背景較深，可再次進(jìn)行封閉然后重新孵育抗體；

3．背景較深時(shí)，亦可將條帶置于洗滌液中放在4℃冰箱保存過夜，浸泡一晚甚至更長時(shí)間后再去顯影，可以有效降低背景，但需以不影響目的帶為宜。