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嘉峪檢測(cè)網(wǎng) 2024-09-26 16:56
摘要
病毒樣顆粒（VLPs）是一類能夠自行組裝，具有重復(fù)抗原表位，能夠刺激機(jī)體免疫反應(yīng)且不含病毒遺傳物質(zhì)的蛋白納米顆粒。在疫苗研發(fā)、藥物靶向運(yùn)輸和生物工程材料方面VLPs具有重要的研發(fā)價(jià)值和應(yīng)用潛力。本研究對(duì)VLPs疫苗誘導(dǎo)免疫反應(yīng)的機(jī)制、現(xiàn)有的VLPs表達(dá)技術(shù)、防治病毒感染等方面的研究進(jìn)展進(jìn)行了綜述，為VLPs疫苗的設(shè)計(jì)和研發(fā)提供參考。
疫苗接種能夠以低成本且高效的方式應(yīng)對(duì)公共衛(wèi)生事件與各種流行病的傳播，是人類目前最為重要的醫(yī)療干預(yù)措施之一［1］。目前的疫苗種類包括減毒疫苗、滅活疫苗、核酸（DNA/RNA）疫苗和亞單位疫苗等。其中減毒或滅活疫苗含有已經(jīng)減弱毒力或失去活性的病原體以模擬疾病感染從而獲得免疫力；核酸疫苗遞送病原體遺傳物質(zhì)進(jìn)入人體，激活免疫系統(tǒng)引起免疫應(yīng)答；亞單位疫苗的抗原成分為病原體的選定片段，包括抗原多肽、蛋白、多糖以及可形成病毒樣顆粒（virus-like particles，VLPs）的病毒結(jié)構(gòu)蛋白等。與其他類型疫苗相比，亞單位疫苗具有明確的靶抗原成分，可以彌補(bǔ)其他疫苗因抗原變異、毒力返祖等引起相關(guān)的安全性問題，以及嚴(yán)格的儲(chǔ)存要求和針對(duì)快速突變的病原體較低功效等功能性缺陷［2,3］。作為亞單位疫苗的一種，VLPs近些年來在生物醫(yī)學(xué)與生物工程學(xué)領(lǐng)域扮演著重要的角色，成為疫苗開發(fā)領(lǐng)域極具潛力的研發(fā)方向［4］。
VLPs是一種能夠自組裝的納米顆粒，其組成成分包括病毒衣殼蛋白、核心蛋白或包膜蛋白等能夠刺激人體產(chǎn)生免疫力的特定病毒蛋白，分為有包膜和無包膜VLPs。VLPs同時(shí)也可以由非病毒或人工合成方式形成的具有一定對(duì)稱結(jié)構(gòu)的蛋白納米顆粒［5］。由于其內(nèi)部不具有病毒核酸成分，因而不具有感染性。VLPs可以自組裝成二十面體、桿狀或球狀等結(jié)構(gòu)，能夠通過原核細(xì)胞系，酵母細(xì)胞系統(tǒng)，植物細(xì)胞，動(dòng)物細(xì)胞等進(jìn)行重組表達(dá)的方式人工獲得。VLPs最早作為在原子水平上分析病毒結(jié)構(gòu)的重要工具，隨著深入的研究其逐漸被用于多個(gè)領(lǐng)域。VLPs作為能夠加載各種藥物產(chǎn)品將其遞送至特定的細(xì)胞或組織的納米載體正在被開發(fā)成為藥物遞送系統(tǒng)［4］。在疫苗研發(fā)領(lǐng)域，VLPs被用于抗病毒、抗菌以及腫瘤疫苗等方向的研發(fā)。VLPs可以組裝成類似于天然病毒結(jié)構(gòu)的空間立體構(gòu)型，具有重復(fù)抗原表位，能夠以高價(jià)態(tài)形式刺激機(jī)體免疫反應(yīng)；納米級(jí)別的尺寸使其能高效被免疫細(xì)胞攝取而進(jìn)入淋巴系統(tǒng)；其表面可以展示不同來源的抗原結(jié)構(gòu)，便于根據(jù)不同病原體而定制化設(shè)計(jì)疫苗；并且其具有免疫佐劑效應(yīng)，能夠模擬病毒感染并刺激人體的免疫系統(tǒng)從而誘導(dǎo)產(chǎn)生免疫保護(hù)反應(yīng)。廣泛的抗原來源為VLPs疫苗的開發(fā)提供了多種應(yīng)用場(chǎng)景，能夠使用不同重組表達(dá)體系進(jìn)行大規(guī)模生產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)使得VLPs疫苗的開發(fā)更具經(jīng)濟(jì)效益。與此同時(shí)，VLPs疫苗本身仍存在一些不足之處，如誘導(dǎo)CD8+T細(xì)胞免疫的效果可能不夠理想，可以通過結(jié)合使用刺激細(xì)胞免疫的佐劑或抗原來改善其效果［6］。與其他類型的疫苗類似，VLPs疫苗可能會(huì)引起注射部位腫脹或疼痛，且部分接種人群可能預(yù)先感染過此類病毒，并阻礙機(jī)體對(duì)此類VLPs疫苗的免疫應(yīng)答［7,8］。
本文綜述了VLPs疫苗誘導(dǎo)產(chǎn)生免疫反應(yīng)的機(jī)制，總結(jié)了VLPs疫苗的表達(dá)平臺(tái)，列舉和歸納了現(xiàn)階段VLPs疫苗針對(duì)相關(guān)疾病的實(shí)際應(yīng)用，對(duì)VLPs疫苗存在的優(yōu)點(diǎn)與不足進(jìn)行了概括總結(jié)，為VLPs抗病毒疫苗的設(shè)計(jì)和研發(fā)提供了參考。
一、VLPs疫苗誘導(dǎo)免疫反應(yīng)的機(jī)制
作為亞單位疫苗的一種，VLPs疫苗可以很好地克服傳統(tǒng)疫苗使用具有感染性或滅活病原體的局限性來實(shí)現(xiàn)其安全性和有效性［9］。不同于一般的亞單位疫苗，VLPs蛋白顆粒保留了天然病毒特征性的結(jié)構(gòu)蛋白，包含具有免疫原性的抗原基序。VLPs可以自組裝成蛋白顆粒，且在VLPs內(nèi)部也不具有病毒核酸成分，因此可以模擬天然病毒類似的感染途徑被免疫系統(tǒng)識(shí)別和加工而沒有毒力返祖的風(fēng)險(xiǎn)。VLPs表面可以通過多價(jià)的形式呈現(xiàn)不同來源病原體的抗原表位。同源VLPs含有天然病毒蛋白質(zhì)，異源VLPs由于含有不同來源的抗原成分能夠獲得針對(duì)多種不同病原體的免疫原性，這些特點(diǎn)使VLPs具有能夠在體內(nèi)誘導(dǎo)體液和細(xì)胞免疫反應(yīng)的能力［9,10,11］。
VLPs疫苗進(jìn)入體內(nèi)后，細(xì)胞攝取VLPs的途徑分為多種類型。除了非特異性的吞噬、巨吞飲作用外，還可以通過網(wǎng)格蛋白依賴和非依賴（受體介導(dǎo)）等內(nèi)吞形式攝取VLPs［6］。VLPs自身含有的病原體相關(guān)分子模式（pathogen-associated molecular patterns，PAMP），能夠與抗原遞呈細(xì)胞（antigen presenting cell，APC）如樹突狀細(xì)胞（dendritic cell，DC）細(xì)胞表面或內(nèi)部的模式識(shí)別受體（pattern recognition receptor，PRR）如Toll樣受體（toll-like receptor，TLR）、Nod樣受體（nod-like receptor，NLR）和RIG l樣受體（RIG-I-like receptors，RLR）等發(fā)生結(jié)合并活化APC。相比其他APC，DC能夠更有效地?cái)z取VLPs［10，12］。VLPs進(jìn)入APC胞內(nèi)，在吞噬溶酶體中被消化，加工得到的抗原肽被加載到主要組織相容性復(fù)合物（MHC）Ⅱ類分子上并呈遞給CD4+輔助性T細(xì)胞（helper t lymphocyte，Th）。Th細(xì)胞通過表面的TCR識(shí)別MHCⅡ分子提呈的抗原表位，在細(xì)胞因子信號(hào)和共刺激信號(hào)的共同作用下刺激B細(xì)胞的增殖與活化，在Th細(xì)胞相互作用下，促進(jìn)抗體和記憶性B細(xì)胞的產(chǎn)生［13］。由于VLPs能夠與B細(xì)胞表面BCR發(fā)生高度交聯(lián)，還可以直接活化B細(xì)胞誘導(dǎo)T細(xì)胞非依賴性的體液免疫反應(yīng)［13,14］。VLPs的高度重復(fù)表面可以促進(jìn)與先天性體液免疫成分的相互作用，介導(dǎo)APC的調(diào)理和吞噬作用，APC被VLPs激活后能夠促進(jìn)基于T、B細(xì)胞的免疫反應(yīng)［15］。除了刺激CD4+T細(xì)胞活化，VLPs還能夠通過交叉遞呈途徑誘導(dǎo)CTL細(xì)胞免疫應(yīng)答。VLPs的抗原呈遞并不局限于MHC-Ⅱ，顆粒狀VLPs可以被APC攝取并將抗原片段交叉呈遞于MHC-Ⅰ類分子表面，促進(jìn)CD8+T細(xì)胞活化。VLPs抗原片段加載于MHC-Ⅰ分子的過程可以通過與抗原轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（transporter-associated with antigen processing，TAP）非依賴性或TAP依賴性內(nèi)體途徑相關(guān)的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白來實(shí)現(xiàn)?；罨腃TL細(xì)胞能夠通過釋放穿孔素和顆粒酶，或經(jīng)死亡受體和死亡受體配體（Fas/FasL）途徑有效殺傷靶細(xì)胞［9，16,17］。見圖1。
圖1病毒樣顆粒疫苗的表達(dá)平臺(tái)和誘導(dǎo)免疫反應(yīng)的機(jī)制
在設(shè)計(jì)VLPs疫苗時(shí)，模式識(shí)別受體（如TLR7、8、9等）的活化對(duì)于適應(yīng)性免疫應(yīng)答的激活起到重要作用?？梢詫⑼庠葱宰魟┤鏑pG、ssRNA等共價(jià)結(jié)合至VLPs表面或者包裝于VLPs內(nèi)部，從而對(duì)模式識(shí)別受體產(chǎn)生更好的活化作用。在設(shè)計(jì)誘導(dǎo)CTL的VLPs疫苗時(shí)，CpG是常用的佐劑之一。CpG能夠活化TLR9，產(chǎn)生Th1偏向性免疫反應(yīng)，引發(fā)強(qiáng)烈的T、B細(xì)胞反應(yīng)，誘導(dǎo)生產(chǎn)更加長(zhǎng)壽的漿細(xì)胞，長(zhǎng)期維持高水平的抗體滴度［8］。通過將ssRNA封裝于VLPs內(nèi)部，被免疫細(xì)胞攝取后ssRNA能夠結(jié)合并激活Toll樣受體如TLR7和TLR8，引發(fā)下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，誘導(dǎo)細(xì)胞因子（TNFα、IFNα、IFNγ和IL-6等）的表達(dá)，在較低劑量下誘導(dǎo)機(jī)體免疫應(yīng)答［7］?；谥Z如病毒（GII.P16-GII.2型）VLPs疫苗的研究中發(fā)現(xiàn)，和DC相比，VLPs能夠更加有效地激活巨噬細(xì)胞表型的成熟，促使巨噬細(xì)胞進(jìn)行M1型方向的活化并釋放炎性細(xì)胞因子，活化CD4+T細(xì)胞引發(fā)Th1型免疫應(yīng)答，誘導(dǎo)細(xì)胞和體液免疫應(yīng)答［18］。
二、VLPs的重組表達(dá)技術(shù)
穩(wěn)定且可靠的表達(dá)平臺(tái)對(duì)于VLPs疫苗的生產(chǎn)至關(guān)重要。VLPs表達(dá)平臺(tái)應(yīng)具有高效率、高產(chǎn)量、便捷、快速、低成本、安全生產(chǎn)等特點(diǎn)［6，19］。VLPs表達(dá)系統(tǒng)還需確保蛋白質(zhì)能夠進(jìn)行正確地折疊和翻譯后修飾，這些條件與VLPs疫苗能否實(shí)現(xiàn)刺激免疫應(yīng)答的功能直接相關(guān)［5］。目前能夠用于VLPs的表達(dá)平臺(tái)包括細(xì)菌、酵母、桿狀病毒/昆蟲細(xì)胞（B/IC）系統(tǒng)、哺乳動(dòng)物細(xì)胞、植物、活動(dòng)物和無細(xì)胞系統(tǒng)等［5,6，19］。
細(xì)菌表達(dá)系統(tǒng)是目前應(yīng)用最廣泛的重組蛋白表達(dá)系統(tǒng)之一。目前成功表達(dá)的174種不同類型的VLPs中，約28%是在細(xì)菌系統(tǒng)中表達(dá)的［20］。細(xì)菌本身存在翻譯后修飾（posttranslational modification，PTM）能力有限、表達(dá)的蛋白可能存在溶解度低和二硫鍵錯(cuò)配等問題，此體系適用于包含一種或兩種病毒結(jié)構(gòu)蛋白的無包膜VLPs的重組表達(dá)。由于原核表達(dá)系統(tǒng)的安全性、成本效益以及能滿足全球性的使用等優(yōu)勢(shì)，基于原核細(xì)胞的表達(dá)系統(tǒng)仍被視為生產(chǎn)VLPs的最佳平臺(tái)［5，20,21,22］。其中大腸桿菌（Escherichia coli，E.coli）是最為常見的VLPs細(xì)菌表達(dá)平臺(tái)，其生產(chǎn)成本低、表達(dá)水平高、易于放大且周轉(zhuǎn)時(shí)間短，常被用于生產(chǎn)結(jié)構(gòu)相對(duì)簡(jiǎn)單且PTM需求不高的VLPs疫苗［5，20］。Hecolin是第一個(gè)成功商業(yè)化的戊型肝炎病毒（hepatitis e virus，HEV）VLPs疫苗，其生產(chǎn)使用E.coli表達(dá)平臺(tái)［20］。利用E.coli表達(dá)體系，通過與大腸桿菌中的噬菌體QβRNA進(jìn)行抗原綴合開發(fā)了多種針對(duì)非感染性疾?。òǜ哐獕骸⑦^敏、糖尿病、癌癥和阿爾茨海默病等）的嵌合VLPs疫苗［5］。
酵母細(xì)胞是研究最深入的真核表達(dá)體系之一，是基因工程生物材料與重組蛋白藥物制劑的優(yōu)良表達(dá)宿主［23］。酵母作為重組表達(dá)體系具有成本低、產(chǎn)率高、純化簡(jiǎn)單、支持高密度發(fā)酵和分泌表達(dá)等優(yōu)勢(shì)。此外，酵母避免了細(xì)菌和哺乳動(dòng)物細(xì)胞等內(nèi)毒素和病毒污染等相關(guān)的問題。不同于原核系統(tǒng)，酵母體系的PTM能夠幫助重組蛋白形成正確構(gòu)象并更好地發(fā)揮其生物學(xué)效應(yīng)［22,23,24,25］。由于酵母表達(dá)體系在蛋白質(zhì)糖基化方面與哺乳動(dòng)物細(xì)胞存在差異，因此酵母常被用作生產(chǎn)無包膜VLPs［21］。首個(gè)酵母系統(tǒng)表達(dá)的HBV-VLPs疫苗于1986年獲得美國(guó)FDA批準(zhǔn)后，基于酵母體系表達(dá)的多種VLPs疫苗陸續(xù)獲批上市或進(jìn)入臨床實(shí)驗(yàn)［21，26］。基于畢赤酵母系統(tǒng)的基孔肯雅病毒（chikungunya virus，CHIK）VLPs疫苗在小鼠模型中免疫效果評(píng)估與滅活病毒相當(dāng)［26］。
相較于其他表達(dá)體系，哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)的目標(biāo)蛋白質(zhì)產(chǎn)量相對(duì)較低，但其在蛋白折疊、組裝與形成完整的PTM方面具有優(yōu)異的表現(xiàn)［5，27］。目前，市場(chǎng)上幾乎50%以上的生物制藥產(chǎn)品和臨床開發(fā)中的候選產(chǎn)品都基于哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)體系，動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)體系能夠被用來表達(dá)包膜和無包膜VLPs［28］。包括倉鼠卵巢細(xì)胞（CHO）、人胚腎293（HEK 293）細(xì)胞、幼倉鼠腎細(xì)胞（BHK-21）、CAP-T和Vero等多種動(dòng)物細(xì)胞系被用于生產(chǎn)重組VLPs［5，28］。CHO細(xì)胞被用于表達(dá)HBsAg VLPs、登革熱病毒和漢坦病毒VLPs，HEK296細(xì)胞和CAP-T細(xì)胞系能夠用于HIV-VLPs的高效表達(dá)［29,30,31］，Vero E6細(xì)胞系成功表達(dá)了SARS-CoV-2VLPs用于臨床測(cè)試［32］。
桿狀病毒/昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)（baculovirus/insect cell expression system，B/IC）同樣常用于生產(chǎn)包膜和非包膜VLPs［5］。B/IC系統(tǒng)可以產(chǎn)生與細(xì)菌和酵母系統(tǒng)相當(dāng)?shù)腣LPs表達(dá)量，但其由于具有相對(duì)于原核體系更強(qiáng)的PTM效果和作為基因治療載體的能力在藥物研發(fā)和生產(chǎn)方面更具優(yōu)勢(shì)［22］。桿狀病毒表達(dá)載體系統(tǒng)（baculovirus expression vector system，BEVS）平臺(tái)作為抗病毒疫苗成熟的生產(chǎn)平臺(tái)，具有速度快、靈活設(shè)計(jì)和可擴(kuò)展性等優(yōu)勢(shì)。桿狀病毒具有自發(fā)感染昆蟲細(xì)胞的傾向，利用B/IC平臺(tái)生產(chǎn)VLPs能夠達(dá)到商業(yè)化規(guī)模的需求［33］。桿狀病毒表達(dá)體系設(shè)計(jì)快速且簡(jiǎn)便，有助于生產(chǎn)表面結(jié)構(gòu)蛋白易發(fā)生變異的傳染性疾病疫苗［22］?；贐/IC表達(dá)系統(tǒng)的HPV疫苗Cervarix是一種由HPV 16和HPV 18 L1 VLPs構(gòu)成的二價(jià)HPV疫苗，于2009年獲得FDA批準(zhǔn)上市［5］。
植物表達(dá)系統(tǒng)是有效且可擴(kuò)展的VLPs表達(dá)平臺(tái)，生成的重組蛋白具有可溶性好、低成本、蛋白表達(dá)水平高和蛋白質(zhì)正確折疊能力優(yōu)良等優(yōu)點(diǎn)［5］。在葉綠體中表達(dá)的生物制藥產(chǎn)品和疫苗可以在合適溫度下穩(wěn)定保存多年，并且保留蛋白質(zhì)正確折疊的構(gòu)象和生物學(xué)效應(yīng)［34］。葉綠體基因工程可以將基因整合到高度多倍體的葉綠體基因組中（每個(gè)細(xì)胞多達(dá)10 000個(gè)基因拷貝），因而可以產(chǎn)生高水平的外源蛋白質(zhì)表達(dá)［35］。植物細(xì)胞還可以用植物病毒遞送外源基因進(jìn)行表達(dá)，如使用煙草花葉病毒（tobacco mosaic virus，TMV）進(jìn)行重組表達(dá)產(chǎn)量大、效率高，是重組植物疫苗的里程碑［36,37］；煙草植物、馬鈴薯塊莖等植物重組表達(dá)體系已經(jīng)成功表達(dá)了HBV、HPV和流感VLPs疫苗［5］。由于植物來源的VLPs有高度有序的重復(fù)堆積結(jié)構(gòu)，比體內(nèi)的可溶性蛋白質(zhì)更能抵抗消化酶的作用，一些植物來源的VLP疫苗可以實(shí)現(xiàn)口服給藥［36］。
無細(xì)胞蛋白合成系統(tǒng)（cell-free protein synthesis，CFPS）也可以用于VLPs的生產(chǎn)，通過保留蛋白質(zhì)合成能力的細(xì)胞提取物，為蛋白質(zhì)的體外生產(chǎn)提供了更多的選擇［5，38］。作為合成生物學(xué)的關(guān)鍵平臺(tái)，CFPS系統(tǒng)節(jié)省時(shí)間，蛋白產(chǎn)量大，可以避免蛋白質(zhì)對(duì)活細(xì)胞的毒性，并且能夠?qū)⑷斯ず铣傻姆翘烊话被嵋隫LPs疫苗結(jié)構(gòu)中，是VLPs疫苗生產(chǎn)一種有廣闊前景的工具［6，39,40］。活體動(dòng)物如寄生蟲表達(dá)系統(tǒng)也可以用于VLPs的表達(dá)，此系統(tǒng)不僅具有形成蛋白質(zhì)天然構(gòu)象和完整的PTM的優(yōu)勢(shì)，而且更加安全高效。利用非致病性利什曼原蟲L.tarentolae表達(dá)VLPs可以為VLPs疫苗的生產(chǎn)提供替代方案［41］。
VLPs在重組表達(dá)和生產(chǎn)過程中，蛋白質(zhì)的正確折疊和PTM的程度是選擇適合表達(dá)系統(tǒng)的關(guān)鍵性因素。對(duì)于有包膜的VLPs的大規(guī)模生產(chǎn)可以選擇哺乳動(dòng)物、昆蟲細(xì)胞或無細(xì)胞系統(tǒng)進(jìn)行表達(dá)；而對(duì)于無包膜VLPs可以選擇經(jīng)濟(jì)快捷的細(xì)菌或酵母體系；針對(duì)快速變異的病毒如流感病毒等同樣可以選擇原核細(xì)菌體系，便于快速應(yīng)對(duì)病毒突變株帶來的威脅。總體來說，細(xì)菌體系和酵母體系經(jīng)濟(jì)快捷，易于生產(chǎn)，但細(xì)菌體系缺乏PTM體系，酵母則不具有形成復(fù)雜PTM的體系，常用于無包膜VLPs的生產(chǎn)。B/IC系統(tǒng)和植物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)量高，成本經(jīng)濟(jì)，但B/IC系統(tǒng)其N-糖基化相對(duì)簡(jiǎn)單，可能會(huì)是其潛在缺點(diǎn)。哺乳動(dòng)物細(xì)胞PTM程度高，有利于復(fù)雜結(jié)構(gòu)VLPs疫苗的生產(chǎn)；但其主要劣勢(shì)在于生產(chǎn)成本高，且產(chǎn)量較低。無細(xì)胞系統(tǒng)進(jìn)行VLPs的表達(dá)其產(chǎn)量近些年來得到了提升，但其商業(yè)化應(yīng)用受限于生產(chǎn)成本，一般作為額外的選擇方案［5］。
三、VLPs抗病毒疫苗的主要研究進(jìn)展
VLPs由于保留了天然病毒的有效抗原表位，并且不含病毒遺傳物質(zhì)，不具有感染性，因此在抗病毒疫苗的研發(fā)方面具有天然優(yōu)勢(shì)。本文歸納了VLPs疫苗在乙型肝炎病毒、腸道病毒、寨卡病毒、人乳頭瘤病毒、流感病毒和新型冠狀病毒等方面的主要研究進(jìn)展（表1）。
表1 病毒樣顆粒抗病毒疫苗的應(yīng)用進(jìn)展
注：HBV為乙型肝炎病毒；HPV為人乳頭瘤病毒；EV為腸道病毒；CPMV為豇豆花葉病毒；WHcAg為土撥鼠肝炎核心抗原；HBcAg 為乙肝病毒核心抗原；HA為血凝素；NA為神經(jīng)氨酸酶
（一）乙型肝炎病毒疫苗
乙肝病毒（hepatitis b virus，HBV）感染是全球所面臨的一個(gè)重大公共安全問題，接種乙肝疫苗是目前最有效的預(yù)防策略。第一代乙肝疫苗屬于血漿衍生疫苗，在當(dāng)時(shí)針主要對(duì)于高危人群使用。第二代基因工程疫苗使用乙肝表面抗原（hepatitis b surface antigen，HBsAg）作為主要抗原，使用酵母細(xì)胞進(jìn)行表達(dá)且能夠自組裝為病毒樣顆粒。二代HBV疫苗是第一個(gè)獲批上市的VLPs疫苗，其顯著降低了HBV的全球流行率，在疫苗學(xué)領(lǐng)域具有里程碑式的意義［9，42］?；贖BsAg-VLPs的第三代HBV疫苗Sci-B-Vac™在第二代疫苗的基礎(chǔ)上進(jìn)行優(yōu)化，含有S蛋白、Pre-S1蛋白和Pre-S2蛋白3種抗原組分，使用哺乳動(dòng)物CHO細(xì)胞進(jìn)行表達(dá)，能夠在低劑量（2.5~10μg）誘導(dǎo)下獲得高滴度的抗HBsAg和針對(duì)Pre-S蛋白的保護(hù)性抗體［43］。第三代HBV疫苗目前已經(jīng)獲批在東亞的14個(gè)國(guó)家等使用，安全使用人數(shù)達(dá)到30多萬人。其在老年人或免疫功能低下以及腎臟移植等患者中仍然收獲了良好的免疫效果，并有望成為慢性HBV感染的治療性疫苗［9］。Pre-S抗原可以提供T細(xì)胞和B細(xì)胞表位，誘導(dǎo)細(xì)胞免疫與體液免疫，有望作為新型HBV疫苗的潛在抗原成為HBsAg的替代和補(bǔ)充［44］。使用流感病毒M1蛋白和流感病毒血凝素（hemagglutinin，HA）的跨膜結(jié)構(gòu)域和胞質(zhì)尾部結(jié)構(gòu)域作為支架組成的Pre-S VLPs，在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中誘導(dǎo)了高水平的體液與細(xì)胞免疫反應(yīng)。該疫苗在保護(hù)小鼠免受HBV DNA的流體動(dòng)力學(xué)轉(zhuǎn)染方面也表現(xiàn)出明確的效果，表明了其在新型HBV預(yù)防和治療性疫苗方向具有潛力［44］。通過生物和免疫信息學(xué)評(píng)估和設(shè)計(jì)的一種基于乙肝核心抗原（hepatitis b core antigen，HBcAg）且含有HBsAg免疫原性結(jié)構(gòu)域的VLPs疫苗，將HBsAg的抗體結(jié)合片段置于HBcAg的主要免疫優(yōu)勢(shì)區(qū)（major immunodominant region，MIR）表位來刺激多邊免疫反應(yīng)，以獲得針對(duì)HBV的廣泛和特異性的B和T細(xì)胞應(yīng)答［45］。與在酵母中表達(dá)的HBsAg相比，無論有無佐劑，在HEK293F細(xì)胞中表達(dá)的高度N糖基化的HBsAg VLPs在BALB/c小鼠模型中均顯示出增強(qiáng)的免疫原性［46］。為了應(yīng)對(duì)免疫耐受造成的預(yù)防性疫苗對(duì)慢性肝炎無效的問題，可以將包膜PreS1區(qū)域的8個(gè)B細(xì)胞中和表位結(jié)合到土撥鼠肝炎核心抗原（woodchuck hepatitis virus core antigen，WHcAg）上形成PreS1-WHcAg VLPs治療性疫苗，由于WHcAg和HBcAg無B細(xì)胞表位交叉反應(yīng)性，且CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞表位部分同源，該疫苗可以誘導(dǎo)CD4+T細(xì)胞依賴的B細(xì)胞活化產(chǎn)生抗體，從而產(chǎn)生特異性抗體以克服免疫耐受。WHcAg VLPs疫苗在HBV免疫耐受的轉(zhuǎn)基因小鼠模型中引起了相當(dāng)于野生型小鼠的高滴度PreS1中和抗體水平，有望應(yīng)用于CHB的治療［47］。
（二）腸道病毒疫苗
腸道病毒屬于小RNA病毒科，其中腸道病毒71型（enterovirus 71，EV71）和柯薩奇病毒A16（coxsackie virus A16，CV-A16）多引起手足口病，脊髓灰質(zhì)炎病毒（Poliovirus，PV）同樣屬于腸道病毒家族［48,49］。目前我國(guó)已經(jīng)有3種針對(duì)EV71的滅活疫苗獲批［50］。滅活疫苗因相對(duì)活疫苗較為安全，但其免疫原性不持久，僅能啟動(dòng)體液免疫而缺乏細(xì)胞免疫，且存在抗原表位受損的風(fēng)險(xiǎn)。重組VP1疫苗產(chǎn)生中和抗體水平不高，有抗體依賴性增強(qiáng)（antibody-dependent enhancement，ADE）的風(fēng)險(xiǎn)［50］。EV71包含P1、P2和P3的單鏈陽性RNA基因組，通過蛋白酶3CD可以將P1蛋白加工成為VP1、VP3以及VP0，這三者可以自發(fā)組裝成為正二十面體VLPs［50］。重組表達(dá)的EV71 VLPs在小鼠模型中誘導(dǎo)的IgG水平與滅活EV 71相似，雖然中和滴度方面低于滅活疫苗，但VLPs疫苗能夠抑制EV71從中樞神經(jīng)系統(tǒng)到肌肉組織的轉(zhuǎn)運(yùn)［51］。隨著腸道病毒嵌合抗原研究的深入，用于手足口病（hand foot mouth disease，HFMD）防治的多價(jià)VLPs疫苗的可行性不斷提高。通過將EV71的衣殼蛋白VP1的SP70表位替換為CV-A16形成的二價(jià)嵌合體疫苗EV-A71 VLPs（ChiEV-A71 VLPs），在小鼠模型中能夠有效誘導(dǎo)針對(duì)EV71和CV-A16的細(xì)胞和體液免疫應(yīng)答［52］。提高重組表達(dá)EV71 VLPs疫苗產(chǎn)量，是EV71疫苗開發(fā)和市場(chǎng)化的關(guān)鍵。通過基于密碼子優(yōu)化的P1和3C基因，在畢赤酵母表達(dá)體系中表達(dá)EV71-VLPs，其表達(dá)量可達(dá)270 mg/L，遠(yuǎn)高于Vero細(xì)胞中1.5 mg/L的表達(dá)量。此外，使用昆蟲細(xì)胞/桿狀病毒系統(tǒng)構(gòu)建雙啟動(dòng)子表達(dá)P1和3CD的EV71 VLPs疫苗能夠提高疫苗產(chǎn)量，這表明并入不同啟動(dòng)子具有優(yōu)化VLPs產(chǎn)量的潛力［53］。腸道病毒EV-D68能夠引起兒童呼吸道疾病，少數(shù)還會(huì)造成急性弛緩性脊髓炎（acute flaccid myelitis，AFM）等疾病。利用EV-D68 VP蛋白（VP0、VP1、VP3）形成的VLPs疫苗對(duì)同源或異源EV-D68亞型均有保護(hù)性中和抗體產(chǎn)生，在體內(nèi)能夠防止病毒的全身性傳播［54］。VLPs疫苗同樣可以用于腸道病毒PV引起的脊髓灰質(zhì)炎的預(yù)防，重組表達(dá)的PV的結(jié)構(gòu)蛋白能夠自發(fā)形成VLPs結(jié)構(gòu)刺激機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)性抗體。PV的P1衣殼蛋白與3CD蛋白酶共表達(dá)并且經(jīng)3CD酶切后能夠形成VLPs結(jié)構(gòu)并刺激機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)性抗體。通過B/IC平臺(tái)表達(dá)的VP1、VP2和VP3結(jié)構(gòu)蛋白具有熱穩(wěn)定性，自組裝形成的PV1、PV2和PV3 PV-sVLPs在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中能夠在小鼠脾臟中誘導(dǎo)產(chǎn)生大量的白介素（interleukin，IL）如IL-2、IL-5和干擾素γ（interferonγ，IFN-γ）等細(xì)胞因子，刺激機(jī)體產(chǎn)生強(qiáng)大的體液與細(xì)胞免疫［55］。在BHK-21哺乳動(dòng)物細(xì)胞系統(tǒng)表達(dá)中以改良的痘苗病毒為載體，通過P1和3CD共表達(dá)形成的PV3 SC8 VLPs，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型中產(chǎn)生了有效的保護(hù)性抗體滴度［56］。
（三）寨卡病毒疫苗
寨卡病毒（zika virus，ZIKV）是一種屬于黃病毒科黃病毒屬的蟲媒病毒［57,58］。2015年由美洲開始蔓延至亞非等多個(gè)地區(qū)，其感染可能引發(fā)先天性小頭畸形和自身免疫性神經(jīng)系統(tǒng)疾病格林-巴利綜合征等癥狀［59］。目前尚無獲批的ZIKV疫苗，但已有候選疫苗進(jìn)入臨床試驗(yàn)［60］。E蛋白是黃病毒的主要表面蛋白，參與病毒與細(xì)胞表面的結(jié)合以及膜融合，ZIKV病毒表面E蛋白拷貝數(shù)多達(dá)180個(gè)。E蛋白單體包含EDⅠ、EDⅡ和EDⅢ三個(gè)結(jié)構(gòu)域，其中EDⅢ結(jié)構(gòu)域是生成特異性中和抗體的主要靶標(biāo)抗原，因此成為疫苗研發(fā)的重點(diǎn)［60,61］。通過結(jié)構(gòu)蛋白（C-PrM-E）和非結(jié)構(gòu)蛋白（NS2B-NS3）自組裝形成ZIKV-VLPs疫苗，在小鼠模型中產(chǎn)生的中和抗體滴度顯著高于ln-ZIKV（滅活疫苗）對(duì)照組［62］。將編碼ZIKV結(jié)構(gòu)蛋白PrM-E基因的質(zhì)粒DNA引入HEK293哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)的VLPs能夠在小鼠和非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物中誘導(dǎo)產(chǎn)生中和抗體，并使宿主免受感染［63］。使用ZIKV EDⅢ和HBV核心抗原設(shè)計(jì)的嵌合VLPs，可以提高VLPs疫苗的靶向性，防止交叉反應(yīng)性黃病毒抗體的產(chǎn)生，并且能夠引發(fā)強(qiáng)烈的體液和細(xì)胞免疫反應(yīng)，具有預(yù)防抗體依賴性增強(qiáng)（antibody-dependent enhancement，ADE）效應(yīng)和提高免疫效率方面的潛力［61］。使用腺病毒載體表達(dá)C蛋白、PrM蛋白和E蛋白組裝生成的ZIKV-VLPs顆粒，使用氫氧化鋁、AddaVaxTM和MF 59®作為佐劑，在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中均顯示接種后2~6個(gè)月能夠檢測(cè)到中和抗體的產(chǎn)生，表明其可以作為寨卡病毒疫苗單劑量疫苗候選物［64］。使用土撥鼠WHcAg作為支架嵌合EDⅢCD環(huán)亞結(jié)構(gòu)域形成的VLPs疫苗，在小鼠模型中顯示出了Th1和Th2型介導(dǎo)的免疫反應(yīng)，并能刺激產(chǎn)生與抗體依賴性細(xì)胞毒性（antibody dependent cellular cytotoxicity，ADCC）和補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性（complement dependent cytotoxicity，CDC）相關(guān)的保護(hù)性抗體［65］。將ZIKV EDⅢ嵌合在HBcAg VLPs表面與植物制備的由IgG重鏈和ZIKV EDⅢ融合蛋白組成的重組免疫復(fù)合物（recombinant immune complex，RIC）進(jìn)行共同遞送能夠產(chǎn)生增強(qiáng)的免疫效果［66］。EDⅢ和IgG重鏈N或C末端融合形成的N-RIC和C-RIC與EDⅢ-HBcAg VLPs共同進(jìn)行遞送在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中能夠產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)，產(chǎn)生中和抗體的水平均強(qiáng)于單獨(dú)使用RIC或EDⅢ-HBcAg VLPs進(jìn)行誘導(dǎo)。
（四）人乳頭瘤病毒疫苗
人乳頭瘤病毒（human papilloma virus，HPV）基因組由雙鏈環(huán)狀DNA組成，其晚期區(qū)（late region，LR）編碼HPV主要衣殼蛋白L1和次要衣殼蛋白L2，前者是目前HPV疫苗設(shè)計(jì)的主要靶點(diǎn)［67］。主要衣殼蛋白L1可以自組裝成具有免疫原性的VLPs，目前已有多款基于L1的VLPs疫苗獲批上市，其在預(yù)防同型HPV感染的有效性和安全性方面得到了臨床驗(yàn)證［68］。Merck公司在2006年獲批的四價(jià)HPV疫苗Gardasil用于預(yù)防6、11、16、18型HPV引起的宮頸癌和生殖器疣狀物，隨后開發(fā)的二價(jià)疫苗Cervarix針對(duì)預(yù)防HPV的16、18高危型引起的宮頸癌也于2009年被美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局（food and drug administration，F(xiàn)DA）批準(zhǔn)使用［69］。2014年Gardasil 9被美國(guó)FDA批準(zhǔn)使用于9~26歲的女性和9~15歲的男性，相比于二價(jià)和四價(jià)HPV疫苗，Gardasil 9不僅含有HPV 9、11、16、18 L1 VLPs，還包括了31、33、45、52和58 L1 VLPs［67，69,70］。HPV52 L1 VLPs疫苗將HPV 52的L1基因進(jìn)行了基于畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)的密碼子優(yōu)化，經(jīng)重組表達(dá)的HPV52 L1能夠成功組裝成VLPs顆粒。酵母系統(tǒng)表達(dá)的HPV52 L1成本較低，具有作為在亞洲等地流行的HPV52低成本疫苗的潛力［71］。使用VLPs作為模板與二氧化硅佐劑通過自組裝能夠形成樹莓樣VLP@Silica納米疫苗，當(dāng)使用HBsAg或HPV 18 L1 VLPs作為抗原時(shí)，能夠增強(qiáng)特異性抗體的產(chǎn)生和T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫應(yīng)答［72］。不同于L1抗原表位，L2表位可以針對(duì)不同類型的HPV產(chǎn)生交叉保護(hù)作用，針對(duì)HPV L2保守表位的候選疫苗有望成為Gardasil 9的替代和補(bǔ)充。通過在噬菌體MS2表面展示串聯(lián)的HPV31/16 L2抗原表位形成的MS2-L2 VLPs疫苗，在小鼠模型中產(chǎn)生了針對(duì)不同類型HPV L2表位的高滴度抗體［73］?；谏镄畔W(xué)分析和免疫原性優(yōu)化構(gòu)建的包含了39、68、70三種基因型L1免疫顯性區(qū)域的H39-68FG70-DE嵌合體VLPs，在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中不僅能夠引發(fā)針對(duì)三種血清型的中和抗體，而且在較低劑量下實(shí)現(xiàn)了相當(dāng)于多價(jià)疫苗或更好的交叉中和水平［74］。包含HPV 6、11、16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58和59在內(nèi)的14種型別的重組多價(jià)L1 VLPs疫苗，具有比Gardasil 9更高的免疫保護(hù)范圍，并且已經(jīng)進(jìn)入Ⅱ期試驗(yàn)［75］。將源自L2保守表位的αHPV和一致性序列βHPV序列展示在HPV16/18 L1的DE環(huán)內(nèi)形成的RG2-VLPs，使用明礬作為佐劑能夠有效的誘導(dǎo)L2特異性抗體，避免β型HPV 5的感染。在兔模型中可以避免17種αHPV的感染，具有預(yù)防肛門、生殖器癌和乳頭瘤的潛力［76］。
（五）流感疫苗
除了當(dāng)前引起大流行的SARS-CoV-2病毒，流感病毒也是具有季節(jié)性和周期性流行的病原體之一。人流感病毒分為甲（A）、乙（B）、丙（C）三型，其中甲型流感病毒抗原性易發(fā)生變異，曾經(jīng)引起世界范圍的大流行［77］。HA是流感疫苗開發(fā)的主要靶標(biāo)，以HA作為主要抗原的首個(gè)重組流感疫苗FluBlok在2013年獲得美國(guó)FDA批準(zhǔn)［78］。重組VLPs疫苗可以實(shí)現(xiàn)流感疫苗的快速制備，應(yīng)對(duì)大威脅流感病毒。植物表達(dá)體系可以用于生產(chǎn)基于HA的VLP疫苗［79］，昆蟲細(xì)胞Sf9產(chǎn)生的甲型流感VLPs，其產(chǎn)量比HEK293細(xì)胞高大約35倍，并且高產(chǎn)率的同時(shí)VLPs引起的抗體滴度也更高，優(yōu)于其他表達(dá)系統(tǒng)，有利于商業(yè)化生產(chǎn)［77］。由于HA容易產(chǎn)生抗原漂移，因此需要每年進(jìn)行流感疫苗的更新［80］。神經(jīng)氨酸酶（neuraminidase，NA）同樣屬于流感病毒的表面蛋白，與HA相比其抗原發(fā)生漂移較慢，是流感疫苗重要的抗原表位。由HA和NA構(gòu)成的N1 VLPs疫苗可以提供對(duì)不同抗原HA的流感病毒提供交叉免疫保護(hù)，誘導(dǎo)Th1型免疫應(yīng)答和中和抗體的產(chǎn)生［81］。使用來自A/Anhui/1/2013（H7N9）的HA和NA和來自A/Indonesia/05/2005（H5N1）的基質(zhì)蛋白M1組裝形成的H7N9 VLPs疫苗，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)顯示H7N9 VLP可以產(chǎn)生對(duì)同源H7N9的血凝抑制反應(yīng)和對(duì)異源H7N9的交叉性血凝抑制反應(yīng)，并且在加入皂苷類佐劑后，其反應(yīng)會(huì)提高3~4倍［82］。HA與唾液酸（sialic acid，SA）受體的結(jié)合在流感病毒感染過程中扮演著重要的作用。通過測(cè)試對(duì)比野生型H1-VLPs和無法結(jié)合SA的流感病毒H1（H1N1 A/California/07/09）VLPs疫苗（H1Y98F-VLP），接種H1Y98F-VLP疫苗的小鼠由于改善了淋巴細(xì)胞生發(fā)中心的生成，能產(chǎn)生更強(qiáng)烈持久的體液免疫反應(yīng)。該結(jié)果表明消除HA-SA的結(jié)合有望增強(qiáng)流感疫苗免疫反應(yīng)的質(zhì)量和持久性［83］。由于流感疫苗容易發(fā)生抗原漂移的特點(diǎn)，開發(fā)流感病毒通用疫苗具有重要意義。這類疫苗的設(shè)計(jì)中可以包含更多的保守序列作為抗原表位，如M2蛋白的胞外區(qū)、HA的莖區(qū)和核蛋白等［78］。將M2蛋白、甲流病毒NA莖部和IL-12構(gòu)成的嵌合體細(xì)胞因子（chimeric cytokines，CC）連接在流感病毒血凝素HA表面形成的融合蛋白CCFKH5-VLPs，在小鼠模型中顯示出了針對(duì)多種同源和甲型流病毒亞型的廣泛交叉保護(hù)作用，表明流感病毒保守區(qū)域和細(xì)胞因子序列的使用在流感通用疫苗的開發(fā)設(shè)計(jì)方面極具潛力［84,85］。將SARS-CoV-2刺突蛋白受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域（receptor binding domain，RBD）通過化學(xué)修飾結(jié)合在滅活的流感病毒表面形成的Flu-RBD VLPs疫苗，不僅能夠誘導(dǎo)針對(duì)SARS-CoV-2 RBD特異性IgG抗體的產(chǎn)生，還能產(chǎn)生流感病毒HA特異性免疫應(yīng)答，該疫苗在小鼠模型中表現(xiàn)出對(duì)SARS-CoV-2 Delta變異體和野生型H1N1滅活病毒的中和能力［86］。相比于游離型RBD和單純RBD和Flu混合物，這種疫苗具有增強(qiáng)的誘導(dǎo)細(xì)胞免疫與體液免疫的能力。
（六）新型冠狀病毒疫苗
自WHO自2020年3月將SARS-CoV-2確定為大流行以來，其在全球引起了較高的發(fā)病率與死亡率［87］。SARS-CoV-2具有E、M、N和S四種主要結(jié)構(gòu)蛋白，目前大多數(shù)疫苗的設(shè)計(jì)僅通過靶標(biāo)S蛋白以引發(fā)針對(duì)RBD的中和抗體來預(yù)防感染和降低重癥率，大多數(shù)基于VLPs的疫苗仍需要通過臨床實(shí)驗(yàn)的驗(yàn)證［87,88］。使用重組桿狀病毒系統(tǒng)對(duì)SARS-CoV-2 M和S蛋白進(jìn)行共表達(dá)形成的VLPs疫苗，在倉鼠體內(nèi)能夠誘導(dǎo)中和抗體的產(chǎn)生并且減輕實(shí)驗(yàn)動(dòng)物肺部感染的癥狀［89］。由Medicago Inc.和葛蘭素史克開發(fā)的CoVLP使用流感病毒H5N1（A/Indonesia/5/2005）的HA跨膜和胞質(zhì)區(qū)尾部對(duì)S蛋白同類區(qū)域進(jìn)行替換，生成的VLPs疫苗其有效性在臨床實(shí)驗(yàn)中得到了驗(yàn)證，目前加拿大政府已經(jīng)批準(zhǔn)此疫苗在其國(guó)內(nèi)的臨床使用［90］。SARS-CoV-2多種值得關(guān)注的突變株（variants of concern，VOC）的出現(xiàn)是疫苗設(shè)計(jì)中面臨的挑戰(zhàn)之一，可以通過尋找VOC中保守的抗原序列進(jìn)行疫苗設(shè)計(jì)。通過對(duì)SARS-CoV-2抗原表位進(jìn)行篩選得到的三個(gè)中和性表位（570、636和826）在VOC中高度保守，將這三種多肽表位結(jié)合至豇豆花葉病毒（cowpea mosaic virus，CPMV）和噬菌體QβVLPs表面形成的三價(jià)疫苗制備成微針貼片進(jìn)行皮下給藥，在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中產(chǎn)生了針對(duì)靶表位和S蛋白的高滴度抗體［91］。
四、結(jié)語與展望
VLPs納米顆粒由于其自身獨(dú)特的空間結(jié)構(gòu)、良好的安全穩(wěn)定性、具有重復(fù)性抗原表位以及與免疫細(xì)胞之間的相互作用使其在疫苗研發(fā)、藥物靶向運(yùn)輸和生物工程材料方面具有重要的臨床應(yīng)用價(jià)值。VLPs自身結(jié)構(gòu)的復(fù)雜程度，尤其是含有包膜的VLPs納米顆粒其蛋白表達(dá)和工業(yè)化生產(chǎn)具有一定挑戰(zhàn)。可以通過設(shè)計(jì)穩(wěn)定的真核或無細(xì)胞表達(dá)體系，人工引入能夠提高表達(dá)體系PTMs能力的蛋白酶類，降低有包膜VLPs的表達(dá)難度以提高其產(chǎn)量。傳統(tǒng)的方法進(jìn)行VLPs疫苗的設(shè)計(jì)和研發(fā)測(cè)試周期長(zhǎng)、過程復(fù)雜、結(jié)果不確定性較大，很難及時(shí)應(yīng)對(duì)病原體快速變異和感染性疾病的快速流行的現(xiàn)狀。隨著生物信息學(xué)和免疫信息學(xué)的飛速發(fā)展，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)功能以及抗原與免疫細(xì)胞之間相互作用的預(yù)測(cè)準(zhǔn)確性也得到了極大的提高。這將有利于加快VLPs疫苗的設(shè)計(jì)研發(fā)周期，提高VLPs疫苗的臨床有效性，減少或避免VLPs疫苗副作用的產(chǎn)生，進(jìn)一步降低研發(fā)成本，加快VLPs疫苗的臨床轉(zhuǎn)化和應(yīng)用，以期為突發(fā)性公共衛(wèi)生事件的應(yīng)對(duì)和相關(guān)疾病的防控提供有效解決手段。
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