您當(dāng)前的位置：檢測資訊 > 科研開發(fā)
嘉峪檢測網(wǎng) 2024-09-27 08:13
摘 要： 建立高效液相色譜法在不同檢測波長處同時測定阿咖酚散/膠囊中3種主要雜質(zhì)成分水楊酸、對氨基酚、對氯苯乙酰胺的含量。采用Ultimate LP-C18 （150 mm×4.6 mm， 5 µm）色譜柱，進(jìn)行多波長分析。流動相為磷酸鹽緩沖液（0.01 mol/L磷酸二氫鉀溶液，用磷酸調(diào)節(jié)pH值至2.6±0.1）-甲醇（7∶3），水楊酸、對氨基酚、對氯苯乙酰胺檢測波長分別為241、263、254 nm，流量為0.9 mL/min，柱溫為30 ℃，進(jìn)樣體積為20 µL。3種雜質(zhì)的質(zhì)量濃度在各自范圍內(nèi)與色譜峰面積的線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)均為0.999 8，定量限為0.03~0.14 µg/mL。樣品加標(biāo)平均回收率為97.7%～102.3%，測定結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于3.0%（n=6）。該法可用于阿咖酚散/膠囊中3種主要雜質(zhì)成分的含量測定。
關(guān)鍵詞： 多波長； 高效液相色譜法； 阿咖酚散/膠囊； 雜質(zhì)檢測
阿咖酚散/膠囊作為常用的感冒藥，內(nèi)容物主要為每粒含阿司匹林230 mg、對乙酰氨基酚126 mg、咖啡因30 mg和輔料適量的復(fù)方制劑。因其價格便宜在市場上流通廣泛，臨床上主要用于解熱鎮(zhèn)痛[1]。由于生產(chǎn)阿咖酚散/膠囊的廠家較多，簡單的包裝在生產(chǎn)、運(yùn)輸、儲存中可能產(chǎn)生降解雜質(zhì)。目前實(shí)施的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)有國家食品藥品監(jiān)督管理局國家藥品標(biāo)準(zhǔn)WS-10001-(HD-0941)-2002和YBH 01232010，其中，檢查項(xiàng)只對阿司匹林的降解產(chǎn)物游離水楊酸進(jìn)行雜質(zhì)控制，而對主成分對乙酰氨基酚中可能存在的降解產(chǎn)物對氨基酚、對氯苯乙酰胺未建立限度檢查[2?3]。由于對氨基酚、對氯苯乙酰胺等雜質(zhì)成分具有遺傳毒性、腎毒性等[4?5]，對人體健康存在一定隱患，且阿咖酚散/膠囊的現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)對雜質(zhì)水楊酸的檢查方法不同、限度（散劑為2.0%，膠囊劑為3.0%）控制不同。
筆者通過文獻(xiàn)研究[6?14]發(fā)現(xiàn)阿咖酚散/膠囊的質(zhì)量控制不夠全面準(zhǔn)確、雜質(zhì)檢查方法不一，故建立了多波長高效液相色譜法[15]同時檢測阿咖酚散/膠囊中3種主要雜質(zhì)成分的含量，能夠快速準(zhǔn)確地進(jìn)行定量檢測，為阿咖酚散/膠囊的雜質(zhì)控制及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提升提供依據(jù)。
1、 實(shí)驗(yàn)部分
1.1 主要儀器和試劑
高效液相色譜儀：LC-20AT型，日本島津公司。
紫外分光光度計(jì)：UV-2700型，日本島津公司。
超聲波清洗器：KQ-500E型，昆山市超聲儀器有限公司。
電子天平：XS205DU型，感量為0.01 mg，瑞士梅特勒-托利多公司。
超低溫冷凍儲存箱：DW-FL450型，中科美菱低溫科技有限公司。
甲醇、乙腈：均為色譜純，美國默克密理博公司。
磷酸：優(yōu)級純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑（北京）有限公司。
磷酸二氫鉀：分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑（北京）有限公司。
阿咖酚散/膠囊：共11批，樣品信息及生產(chǎn)廠家見表1。
表1 樣品信息及生產(chǎn)廠家
Tab. 1 Sample information and manufacturer
水楊酸、對氨基酚、對氯苯乙酰胺標(biāo)準(zhǔn)品：純度（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）分別為99.8%、98.2%、100.0%，批號分別為100106-202106、100802-202306、100850-202304，中國食品藥品檢定研究院。
實(shí)驗(yàn)用水：超純水。
1.2 色譜條件
色譜柱：Ultimate LP-C18 柱(150 mm×4.6 mm, 5 µm，美國Welch公司)；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣體積：20 µL；流動相：A相為磷酸鹽緩沖液（取0.01 mol/L磷酸二氫鉀溶液，用磷酸調(diào)解pH值至2.6±0.1），B相為甲醇，等度洗脫，流量為0.9 mL/min；液相洗脫方法見表2。
表2 液相洗脫方法
Tab. 2 Elution method of HPLC
1.3 溶液制備
1.3.1 混合對照品溶液
在避光條件下分別精密稱取水楊酸標(biāo)準(zhǔn)品54.06 mg、對氨基酚標(biāo)準(zhǔn)品8.02 mg、對氯苯乙酰胺標(biāo)準(zhǔn)品4.05 mg，置于同一20 mL棕色量瓶中，加入甲醇適量，振搖使其溶解，并定容至標(biāo)線，作為混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液。
精密量取混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液5 mL，置于同一100 mL棕色容量瓶中，加甲醇稀釋并定容至標(biāo)線，搖勻，作為混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。
1.3.2 系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液
精密量取混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液適量，用甲醇稀釋成系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，其中水楊酸的質(zhì)量濃度分別為270.30、135.15、67.58、33.79、16.89、3.38、0.68 µg/mL，對氨基酚的質(zhì)量濃度分別為40.10、20.05、10.02、5.01、2.51、0.50、0.10 µg/mL，對氯苯乙酰胺質(zhì)量濃度分別為20.25、10.12、5.06、2.53、1.26、0.25、0.05 µg/mL。
1.3.3 樣品溶液
在避光條件下，取《中華人民共和國藥典》2020年版四部“通則0115散劑”中“裝量差異”項(xiàng)下內(nèi)容物（10袋共含阿司匹林2 300 mg、對乙酰氨基酚1 260 mg、咖啡因300 mg和輔料適量的復(fù)方制劑，批號為230101），混合均勻，精密稱取適量（約相當(dāng)于對乙酰氨基酚100 mg），置于10 mL棕色容量瓶中，加入甲醇適量，超聲溶解后，定容至標(biāo)線，搖勻?yàn)V過，作為樣品溶液。
1.3.4 加標(biāo)樣品溶液
在避光條件下，取《中華人民共和國藥典》2020年版四部“通則0115散劑”中“裝量差異”項(xiàng)下內(nèi)容物，混合均勻，精密稱取適量（約相當(dāng)于對乙酰氨基酚100 mg），置于10 mL棕色容量瓶中（平行取樣18份），分別精密加入混合對照品儲備液2.0、2.5、3 mL各6份，再加入甲醇，定容至標(biāo)線，搖勻，濾過。
1.3.5 空白溶液
以甲醇作為空白溶液。所有溶液均在-30°C超低溫冷凍儲存箱下儲存。
1.4 實(shí)驗(yàn)方法
取表1中不同生產(chǎn)廠家的11批樣品按1.3.3方法制備樣品溶液，每批各2份，再按照1.2色譜條件進(jìn)樣測定，利用標(biāo)準(zhǔn)工作曲線外標(biāo)法計(jì)算3種雜質(zhì)成分的含量，水楊酸含量按阿司匹林標(biāo)示量的百分比計(jì)算，對氨基酚及對氯苯乙酰胺含量按對乙酰氨基酚標(biāo)示量的百分比計(jì)算，得到3種雜質(zhì)的測得量（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）見表3。
表3 樣品雜質(zhì)含量（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）測定結(jié)果
Tab. 3 Determination results of impurity content (mass fraction) in the sample ( % )
注：“-”表示未檢測出。
2、 結(jié)果與討論
2.1 測定波長及溶劑選擇
經(jīng)紫外分光光度計(jì)全波長掃描，發(fā)現(xiàn)水楊酸、對氨基酚、對氯苯乙酰胺在240～270 nm波長處有最大吸收，經(jīng)液相色譜進(jìn)樣比較系統(tǒng)適用性參數(shù)后選擇測定波長分別為241、263、254 nm，各待測成分峰形、響應(yīng)值和分離度均較好。對比國家食品藥品監(jiān)督管理局國家藥品標(biāo)準(zhǔn)WS-10001-(HD-0941)-2002和YBH 01232010中單波長等度檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)采用多波長法切換檢測條件下，各成分系統(tǒng)適用性參數(shù)更佳，因此選擇多波長法。
分別考察了甲醇、乙醇、水作為溶劑對測定結(jié)果的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)甲醇作為溶劑時，樣品在1 min內(nèi)超聲能夠完全溶解，而乙醇、水作為溶劑時樣品超聲較難溶解。溶解時間長可能會增加阿司匹林水解，導(dǎo)致雜質(zhì)水楊酸含量增大，因此采用甲醇作為溶劑，結(jié)果發(fā)現(xiàn)樣品峰形等各項(xiàng)色譜參數(shù)均符合測定要求。
2.2 流動相及柱溫選擇
考察磷酸鹽緩沖液在不同pH值下（pH值分別為2.0、2.4、2.6、3.0）與甲醇配制的流動相，發(fā)現(xiàn)pH＜2.6時，對氨基酚與對乙酰氨基酚色譜峰重疊，pH=3.0時，水楊酸的穩(wěn)定性不佳，因此選擇磷酸鹽緩沖液pH=2.6?？疾觳煌壤牧鲃酉嗉?.8、0.9、1.0 mL/min的進(jìn)樣流量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)磷酸鹽緩沖液-甲醇（7∶3）、流量0.9 mL/min的條件下，各待測成分分離度最佳。通過比較不同柱溫下（25、30、35 ℃）混合對照品溶液中各待測物峰面積響應(yīng)及理論塔板數(shù)，結(jié)果見表4。
表4 不同柱溫下各成分的峰面積及理論塔板數(shù)
Tab. 4 Sample impurity content determination results
由表4可知，柱溫為30 ℃時各待測成分峰面積及理論塔板數(shù)最大，因此選擇柱溫為30 ℃。
2.3 專屬性
取空白溶液、混合對照品溶液、加標(biāo)樣品溶液、樣品溶液按照1.2色譜方法進(jìn)樣，色譜圖分別見圖1~圖4。由圖4可知，各成分專屬性強(qiáng)，其他原輔料成分不影響各待測物質(zhì)的含量測定。對氨基酚、水楊酸、對氯苯乙酰胺先后出峰，理論塔板數(shù)均大于2 000，分離度均大于2.0。
圖1 空白溶液色譜圖
Fig. 1 Chromatogram of blank control solution
t/min
圖4 樣品溶液色譜圖
Fig. 4 Chromatogram of sample solution
1—對氨基酚；2—水楊酸
t/min
1—對氨基酚；2—水楊酸；3—對乙酰氨基酚圖2 混合對照品溶液色譜圖
Fig. 2 Chromatogram of mixed standard solution
t/min
1—對氨基酚；2—水楊酸；3—對乙酰氨基酚圖3 加標(biāo)樣品溶液色譜圖
Fig. 3 Chromatogram of spiked sample solution
t/min
2.4 線性關(guān)系與定量限
按照1.2色譜方法測定系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。以質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)，色譜峰面積（y）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，利用加權(quán)最小二乘法進(jìn)行回歸運(yùn)算。以信噪比為10作為各成分的定量限。3種雜質(zhì)成分的線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)及定量限見表5。由表5可知，水楊酸、對氨基酚、對氯苯乙酰胺的質(zhì)量濃度在各自范圍內(nèi)與色譜峰面積具有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)均為0.999 8，定量限分別為0.14、0.05、0.03 µg/mL，表明該方法具有較高的靈敏度，適于定量。
表5 線性回歸方程及定量限結(jié)果
Tab. 5 Linear regression equation and quantitative limit results
2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)
取1.3.3中含混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液2.0 mL的加標(biāo)樣品溶液，于室溫條件下分別避光放置0、2、4、6、8 h，在1.2色譜條件下進(jìn)樣測定，記錄色譜峰面積并帶入線性方程計(jì)算各成分的質(zhì)量濃度，試驗(yàn)結(jié)果見表6。由表6可知，樣品溶液中雜質(zhì)水楊酸隨阿司匹林降解含量逐漸增加；對氨基酚在4 h內(nèi)較為穩(wěn)定，超過4 h后含量逐漸降低；對氯苯乙酰胺在8 h內(nèi)穩(wěn)定，測定結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差小于3.0%，因此樣品測定時應(yīng)臨用現(xiàn)配，配制時間控制在2 h以內(nèi)并立刻進(jìn)樣。
表6 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果
Tab. 6 Stability test results
2.6 樣品加標(biāo)回收率與精密度試驗(yàn)
在避光條件下，選取已知濃度的加標(biāo)樣品溶液，按照1.2色譜方法進(jìn)樣并測定，記錄色譜峰面積，計(jì)算加標(biāo)回收率及測定結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差，試驗(yàn)結(jié)果見表7。由表7可知，水楊酸加標(biāo)平均回收率為99.9%~102.3%，對氨基酚的加標(biāo)平均回收率為97.7%~100.8%，對氯苯乙酰胺的加標(biāo)平均回收率為98.1%~100.7%，測定結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于3.0%，表明該方法具有較高的準(zhǔn)確度和良好的精密度，能夠滿足實(shí)際檢測的需要。
表7 樣品加標(biāo)回收試驗(yàn)結(jié)果
Tab. 7 Sample addition recovery test results
3、 結(jié)語
以紫外光譜掃描的最大吸收波長為參照，采用多波長高效液相色譜法同時檢測阿咖酚散/膠囊中可能存在危害人體健康的3種主要雜質(zhì)。該方法靈敏度高、穩(wěn)定性好，對阿咖酚散/膠囊雜質(zhì)控制方面的不足加以補(bǔ)充，可為阿咖酚散/膠囊質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)提升提供技術(shù)參考。
參考文獻(xiàn)：
1 李萬平，萬莉，張華，等.阿咖酚散中游離水楊酸檢查方法的改進(jìn)［J］.中國藥師， 2017， 20（8）：1 494.
LI Wanping，WAN Li，ZHANG Hua，et al. Improvement of detection method of free salicylic acid in Agafol powder［J］. Chinese Pharmacist，2017， 20（8）：1 494.
2 廖燕萍. 阿咖酚散微生物計(jì)數(shù)方法的建立與研究 ［J］. 海峽藥學(xué)， 2018， 30（11）：60.
LIAO Yanping. Establishment and study of microbiological counting method of Acafol powder［J］. Straits pharmacy，2018， 30（11）：60.
3 趙淑晶，高永堅(jiān)，區(qū)淑蘊(yùn)，等. HPLC法測定對乙酰氨基酚原料藥有關(guān)物質(zhì)及遺傳毒性雜質(zhì)［J］. 廣東藥科大學(xué)學(xué)報，2022，38（3）：13.
ZHAO Shujing，GAO Yongjian，QU Shuyun，et al. Determination of paracetamol related substances and genotoxic impurities by HPLC［J］. Journal of Guangdong Pharmaceutical University，2022，38（3）：13.
4 KHANDAVILLI UBR， KESHAVARZ L， SKO?EPOVÁ E，et al. Organic salts of pharmaceutical impurity p-aminophenol［J］. Molecules， 2020， 25（8）：1 910.
5 曾金亮，周雅麗，龐發(fā)根，等.復(fù)方氨酚溴敏膠囊中對氨基酚的檢查［J］.廣州化工， 2023， 51 （11）：122.
ZENG Jinliang，ZHOU Yali，PANG Fagen，et al. Examination of aminophenol in compound aminophenol bromin capsules［J］.Guangzhou Chemical，2023， 51（11）：1 22.
6 胡海俠，高燕，宏偉.高效液相色譜多波長同時測定阿咖酚散中對乙酰氨基酚、咖啡因、阿司匹林、水楊酸［J］.化學(xué)分析計(jì)量，2021，30（5）：37.
HU Haixia，GAO Yan，HONG Wei，et al. Determination of acetaminophen， caffeine， aspirin and salicylic acid in Acafol powder by high performance liquid chromatography with multiple wavelengths［J］. Chemical Analysis Meterage，2021，30（5）：37.
7 江坤，陳顏清，蔡錦雄，等. HPLC法測定氨酚偽麻那敏分散片中的對氨基酚［J］.中國藥品標(biāo)準(zhǔn)， 2022， 23 （1）：24.
JIANG Kun，CHEN Yanqing，CAI Jinxiong，et al. Determination of paraminophenol in paraminophenol and pseudomanamine dispersive tablets by HPLC［J］. Chinese Drug Standard，2022， 23 （1）：24.
8 王燕桓，劉國瑞，傅承光，等. HPLC法測定阿咖酚散中3種有效成分及相關(guān)雜質(zhì)含量的研究［J］.藥物分析雜志，2006，26（5）：692.
WANG Yanheng，LIU Guorui，F(xiàn)U Chengguang，et al. Determination of 3 active components and related impurities in Agafol powder by HPLC［J］. Journal of Pharmaceutical Analysis，2006，26（5）：692.
9 肖江，王輝，帥海濤，等.高效液相色譜法檢測對乙酰氨基酚片中有關(guān)物質(zhì)［J］.中國藥業(yè)，2022，31（21）：55.
XIAO Jiang，WANG Hui，SHUAI Haitao，et al. Determination of related substances in acetaminophen tablets by high performance liquid chromatography［J］. Chinese Pharmaceutical Industry，2022，31（21）：55.
10 劉晶晶，梁智淵，陳承貴，等. HPLC法測定氨咖黃敏膠囊的有關(guān)物質(zhì)［J］. 中國藥師，2021，24（9）：1 769.
LIU Jingjing，LIANG Zhiyuan，CHEN Chenggui，et al. Determination of related substances in ankahuangmin capsules by HPLC［J］. Chinese Pharmacist，2021，24（9）：1 769.
11 王英瑛，李俊，楊玉琴. HPLC法測定復(fù)方對乙酰氨基酚片中對氨基酚和對氯苯乙酰胺的含量［J］.中國藥師，2018，21（7）：1 303.
WANG Yingying，LI Jun，YANG Yuqin，et al. Determination of p-aminophenol and p-chloroacetamide in compound paracetamol tablets by HPLC［J］. Chinese Pharmacist，2018，21（7）：1 303.
12 程俠，吳毅彥，郝桂明，等.氨酚咖匹林片中對氨基酚和對氯苯乙酰胺的檢測［J］.天津藥學(xué)，2021，33（2）：9.
CHEN Xia，WU Yiyan，HAO Guiming，et al. Determination of para-aminophenol and p-chlorophenol acetamide in para-aminophenol and capilline tablets［J］. Tianjin Pharmacy，2021，33（2）：9.
13 肖羽，陳安麗，尹瑋璐，等.高效液相非接觸電導(dǎo)法測定阿咖酚散3種有效成分的含量［J］.今日藥學(xué)，2016，26（1）：33.
XIAO Yu，CHEN Anli，YIN Weilu，et al. Determination of three active components in Acafol powder by high performance liquid phase non-contact conductance method［J］. Pharmacy Todayt，2016，26（1）：33.
14 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典（2020年版）［M］. 4部.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2020.
National Pharmacopoeia Commission. Pharmacopoeia of the People's Republic of China（2020 Edition）［M］. Part 4. Beijing：China Medical Science and Technology Press，2020.
15 姜軍華，陳建蘭，許妍，等. HPLC多波長切換法同時測定小兒咽扁顆粒中11種成分的含量［J］.中國藥事，2023，37（2）：199.
JIANG Junhua，CHEN Jianlan，XU Yan，et al. Simultaneous determination of 11 components in Xiaoer Yanbian granules by HPLC multi-wavelength switching method［J］.Chinese Pharmaceutical Affairs，2023， 37 （2）：199.
引用本文： 曹夢欣，臧晴晴 . 多波長高效液相色譜法同時測定阿咖酚散/膠囊中3種雜質(zhì)成分［J］. 化學(xué)分析計(jì)量，2024，33（8）：79. (CAO Mengxin, ZANG Qingqing. Simultaneous determination of three impurity components in Akafen powder/capsule by multi-wavelength high performance liquid chromatography[J]. Chemical Analysis and Meterage, 2024, 33(8): 79.)
來源：化學(xué)分析計(jì)量
關(guān)于我們 聯(lián)系我們 營業(yè)執(zhí)照 全國服務(wù)電話：400-818-0021 嘉峪檢測版權(quán)所有 備案號：京ICP備14047019號-2 
京公網(wǎng)安備11010802046783號
