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免疫組織化學(Immunohistochemistry, IHC)技術是利用抗原抗體特異性結合原理建立的技術，利用帶顯色劑的抗體原位特異性的標記組織中的抗原，并利用組織化學的顯色技術，對相應抗原進行定性、定量和定位的技術，廣泛的應用于基礎研究和臨床病理診斷。

 

免疫組織化學技術所需組織切片可以采用石蠟切片、冰凍切片及細胞涂片，其中石蠟切片保存結構較為清晰，但在制備過程中容易損傷抗原；冰凍切片可以較好的保存組織中的抗原，但是切片的清晰度較差。

 

本文以石蠟切片為例介紹免疫組化技術流程：

 

一、固定

 

固定的作用在于保存組織形態(tài)結構和內(nèi)部抗原。常用的固定液是4%多聚甲醛，固定方式以浸泡式固定，固定時間通常為24小時，對于植物組織可以采用抽真空的方式，輔助固定液的滲透。取材部位需準確，不宜過大，過大的組織不易固定，且在后續(xù)實驗中會因為滲透不良而造成組織破碎。

 

具體操作：選取觀測目標位置，用雙面刀片切取2mm左右的組織，于固定液中浸泡固定24h。固定完成后于4℃冰箱保存，待不同處理全部取樣完畢后進行后續(xù)實驗。

 

二、脫水

 

脫水的目的在于脫去組織中的水分，便于石蠟的滲透。石蠟無法與水互溶，水分的存在會造成石蠟滲透不良破碎。

 

配置梯度乙醇，吸棄原有溶液后，依此加入50%乙醇、70%乙醇、80%乙醇、95%乙醇、100%乙醇，每級脫水30min，其中100%乙醇脫水兩次。

 

三、組織透明

 

組織透明是利用二甲苯將組織中的乙醇置換出來，便于后續(xù)石蠟滲透。透明時間通常為60min，也可以根據(jù)你組織大小和類別進行調(diào)整，直至組織呈現(xiàn)透明狀態(tài)為宜。

 

吸棄乙醇，加入二甲苯，于室溫中透明60min兩次，較大的組織透明3次。

 

四、浸蠟和包埋

 

將石蠟和二甲苯按比例混合后進行浸透。采用1:3、1:1、3:1二甲苯：石蠟的混合液進行依此浸透，每次浸透2h，最后再采用純石蠟浸透2-3次，每次2-4h。

 

包埋時，先在包埋模具中注入融化的石蠟，將浸蠟完全的組織調(diào)整好方向置于包埋模具中，凝固后脫模。

 

五、切片

 

將蠟塊按照切片的方向進行塑形后固定到切片機上，切片厚度在4-10um，分辨出需求較高，可以降低切片厚度。切下的組織在35-45℃的溫水中進行展片，若要提高切片的平整度可以在水中加入2-5%的乙醇。撈起的切片在40℃烘箱中烘干后進行后續(xù)實驗。

 

六、抗原修復

 

抗原修復的目的在于暴露細胞內(nèi)的抗原決定簇，常用熱處理法，將切片在檸檬酸緩沖液中，微波爐高火加熱5分鐘取出冷卻后再加熱，共加熱3-4次?？乖迯颓跋葘η衅M行脫蠟和復水，保證抗體與組織內(nèi)的抗原可以充分結合。

 

二甲苯脫蠟10min*2次

 

梯度乙醇復水：100%*2、95%、80%、70%乙醇各5min

 

ddH2o：清洗3min*3次

 

PBS：3min*3次

 

七、內(nèi)源性過氧化物酶消除

 

組織中存在內(nèi)源性過氧化物酶，可以與DAB結合顯色，造成假陽性結果，采用H2O2與內(nèi)源性過氧化物酶反應進行消除。具體做法：3%H2O2孵育10min，PBS清洗3次，每次3min。

 

八、血清封閉、抗體孵育

 

采用與二抗同源的血清進行封閉處理，防止非特異性結合；根據(jù)實驗目的選擇合適的抗體，特異性的識別目的蛋白，初次實驗，可以稀釋不同的抗體濃度，優(yōu)化最佳的抗體濃度，如1：250，1:500，1:1000。

 

血清封閉1h，棄去血清后加一抗孵育，室溫孵育1h后轉(zhuǎn)入4℃孵育過夜。

 

九、顯色、復染、封片

 

抗原抗體復合物沒有顏色，需要借助化學基團的顯色作用才能在顯微鏡下進行觀察。常用的試劑為3,3-二氨基聯(lián)苯胺四鹽酸鹽（DAB），在HRP的催化作用下，H2O2將DAB氧化成還原型的DAB，呈現(xiàn)棕色不溶性沉淀。

 

為了突出細胞輪廓，便于目標蛋白定位，通常采用蘇木素進行復染，染色后清洗5min，置于氨水中返藍5min，在進行依次脫水、透明、封片：

 

DAB室溫孵育3min-清洗3min-蘇木素染色1min-清洗5min-氨水返藍5min-50%乙醇、70%乙醇、80%乙醇、95%乙醇、100%乙醇、100%二甲苯，每級脫水2min，其中100%乙醇脫水和100%二甲苯透明各兩次；

 

中性樹膠封片進行鏡檢。