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軟骨無血管、無神經(jīng)，其內(nèi)在再生能力有限，因此需要在受傷后進行外部干預(yù)。目前的臨床策略主要側(cè)重于通過止痛藥和消炎藥來緩解癥狀，目前尚無特效治療方法。

為了解決這一問題，來自北京大學(xué)第三醫(yī)院的張辛與北京化工大學(xué)的蔡晴/喻盈捷團隊合作提出了一種壓電導(dǎo)電支架，由壓電軟骨脫細(xì)胞細(xì)胞外基質(zhì)(dECM)和壓電導(dǎo)電改性明膠(Gel-PC)組成。支架的壓電性是通過在孔表面改性二苯丙氨酸(FF)組件實現(xiàn)的，而支架的導(dǎo)電性是通過加入聚(3,4-乙烯二氧噻吩)實現(xiàn)的。支架上層積聚的正電荷吸引BMSC，促使其向上層遷移并向軟骨分化；同時，下層的負(fù)電荷誘導(dǎo)BMSC向成骨分化（方案1），為有效修復(fù)骨軟骨缺損提供了一個有希望的平臺。

相關(guān)研究成果以“Biodegradable Piezoelectric-Conductive Integrated Hydrogel Scaffold for Repair of Osteochondral Defects”為題于2024年9月13日發(fā)表在《Advanced Materials》上。    

方案1 用于修復(fù)和重建骨軟骨缺損的可生物降解壓電導(dǎo)電支架示意圖

1.水凝膠的制備與表征

為了最大限度地發(fā)揮上部壓電材料的電刺激效果，通過集成壓電和導(dǎo)電元件開發(fā)了一種可降解的雙層水凝膠（圖1a）。水凝膠的上部支架來自豬軟骨組織的 dECM，用雙鍵改性，并用FF肽功能化。水凝膠支架的下層是通過將導(dǎo)電聚合物PEDOT與Gel-C結(jié)合而創(chuàng)建的。上部和下部支架使用人纖維蛋白密封劑套件進行粘合。在循環(huán)壓縮之前和之后，上層和下層之間沒有明顯的分離。此外，認(rèn)識到骨和軟骨再生需要支持細(xì)胞遷移的支架，采用梯度冷凍技術(shù)制造具有互連大孔結(jié)構(gòu)的支架（圖1b）。經(jīng)過多次FF肽浸漬處理，實現(xiàn)了FF肽通過自組裝與水凝膠內(nèi)部的結(jié)合，從而制備出雙層水凝膠。  

為了驗證雙層支架的電氣性能，利用電化學(xué)工作站獲取支架材料的循環(huán)伏安法 (C-V) 曲線和電化學(xué)阻抗。將PEDOT添加到凝膠中形成導(dǎo)電明膠 (Gel-P) 和壓電導(dǎo)電明膠(GelPC)，與未改性凝膠相比，其阻抗更低、離子電導(dǎo)率更高、C-V曲線更大。這表明Gel-P和Gel-PC中的電子傳導(dǎo)和存儲容量有所改善（圖 1c-e）。dECM水凝膠的輸出電壓和電流分別約為3 mV和0.25 μA，而dECM-P水凝膠的輸出電壓和電流分別約為20 mV和0.8 μA（圖1f）。此外，F(xiàn)F肽修飾的雙層水凝膠(DPC)的壓電輸出在1000次循環(huán)中和至少21天內(nèi)保持穩(wěn)定（圖1g、h）。為了模擬雙層支架在體內(nèi)的實際應(yīng)用，從上到下模擬了雙層支架的壓縮。有限元分析結(jié)果表明上部支架材料發(fā)生了較大的變形，應(yīng)力主要集中在上下部支架界面處，與壓縮試驗結(jié)果一致（圖1i、j）。 

圖1 壓電導(dǎo)電水凝膠的物理和化學(xué)特性

2.壓電導(dǎo)電水凝膠的體外生物相容性及促分化作用

圖2a概述了體外細(xì)胞實驗的過程，其中力電因子刺激細(xì)胞實現(xiàn)差異化成骨/軟骨分化。將支架與細(xì)胞共培養(yǎng)7天和14天以評估dECM-P和Gel-PC水凝膠的生物相容性。細(xì)胞向支架內(nèi)部遷移，形成三維(3D)培養(yǎng)環(huán)境（圖2b）。細(xì)胞遷移實驗表明壓電效應(yīng)顯著促進了細(xì)胞遷移（圖2c）。此外，在壓電刺激下觀察到最強烈的鈣離子內(nèi)流熒光(圖2d)，這種影響歸因于壓電刺激打開離子通道，從而促進細(xì)胞遷移。    

為了比較dECM-P和Gel-PC對MSCs分化的影響，進行了單獨的軟骨形成和成骨實驗。通過比較這些組，可以評估力和電在細(xì)胞分化中的單獨和聯(lián)合作用。阿爾新藍(lán)染色在dECM、dECM(+)和dECM-P(+)組中逐漸增強，表明酸性粘多糖合成增加，MSCs的軟骨形成分化增強（圖2e）。對于底層的成骨，堿性磷酸酶(ALP)染色隨著力和電刺激的施加而增加。ALP是骨形成的特定標(biāo)志物，在力電因子刺激下表現(xiàn)出更大的成骨趨勢，這與茜素紅染色結(jié)果一致（圖2f）。qPCR量化幾個軟骨代表基因，包括SRY-Box轉(zhuǎn)錄因子 9 (SOX9)、聚集蛋白聚糖(ACAN)和COL-II，以及成骨代表基因，包括骨鈣素(OCN)、ALP和I型膠原蛋白。7天和14天，dECM-P(+)組軟骨相關(guān)基因表達(dá)明顯高于其他組，而Gel-PC(+)組骨相關(guān)基因表達(dá)最高（圖2g、h）。結(jié)果表明，壓電刺激顯著促進MSCs分化。BMSCs的成骨和軟骨形成也與力電因子激活的離子通道有關(guān)。

圖2 評估支架的細(xì)胞相容性、細(xì)胞遷移和細(xì)胞分化

3.轉(zhuǎn)錄組測序揭示力電相互作用在細(xì)胞分化中的作用

為了研究力電刺激因子在細(xì)胞分化中的作用，作者對上層和下層支架進行了RNA測序。這項分析旨在確定力電通路中影響MSC成骨和軟骨分化的關(guān)鍵靶點和分支點。為此，比較了對照組和壓電刺激組中BMSC的整體基因表達(dá)譜。通路富集結(jié)果表明，Toll樣受體信號通路通過Mg2+調(diào)節(jié)MSCs軟骨形成，這與體外結(jié)果一致。FoxO信號通路是軟骨分化的另一個關(guān)鍵組成部分。這些通路為可能的信號傳輸提供了多種選擇（圖3b）。SOX9、COL-II A1和ACAN的RNA測序結(jié)果為各組之間的分化提供了進一步的證據(jù)（圖3c）?；蚣患治觯℅SEA）結(jié)果如圖3d所示，表明dECM-P(+)組與細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用和細(xì)胞粘附分子呈正相關(guān)。   

圖3 上層（軟骨形成分化）和下層（成骨分化）的RNA測序

4.全層骨軟骨再生的體內(nèi)效果評估

基于以上實驗結(jié)果，作者進行了體內(nèi)實驗以驗證壓電導(dǎo)電水凝膠在全層骨軟骨再生的效果（圖4a）。為了確認(rèn)該材料在體內(nèi)保留了其壓電特性，我們模擬了兔膝關(guān)節(jié)，并使用神經(jīng)電極測量了膝關(guān)節(jié)運動期間的電輸出。結(jié)果表明，關(guān)節(jié)運動引起的變形產(chǎn)生穩(wěn)定的電壓輸出，異常波動最小，與實驗設(shè)計一致（圖4b）。為了驗證設(shè)計的壓電導(dǎo)電支架在生物體中修復(fù)的實際效果，模擬了骨軟骨缺損。帕爾馬豬的生理結(jié)構(gòu)與人類相似，因此為臨床應(yīng)用提供了堅實的基礎(chǔ)，被用作實驗對象。術(shù)后6個月收集樣本，并使用成像、病理學(xué)和納米力學(xué)評估修復(fù)效果。膝關(guān)節(jié)目視觀察顯示，D-PC組軟骨覆蓋完整，缺損中心完全修復(fù)并與正常軟骨融合良好。在D-P組中，缺損中心的軟骨得到修復(fù)但未完全填充。D-C組和D-N組分別顯示小凹陷和大凹陷，新軟骨形成仍不足以恢復(fù)正常功能（圖4c）。國際軟骨修復(fù)協(xié)會（ICRS）評分顯示兩組之間存在統(tǒng)計學(xué)上的顯著差異（圖4d）。磁共振成像（MRI）證實了這些發(fā)現(xiàn)。D-N組顯示代表軟骨層的突出顯示白線明顯斷裂，表明軟骨修復(fù)不完全。D-C組和D-P組出現(xiàn)一些模糊，表明修復(fù)效果不佳。然而，D-PC組顯示連貫的軟骨層，表明修復(fù)效果優(yōu)異（圖4c）。采用微型計算機斷層掃描(micro-CT)評估軟骨下骨的重建修復(fù)情況。各組之間的骨小梁厚度存在顯著差異，具有很強的統(tǒng)計學(xué)意義(圖4e)。3D重建圖像清楚地說明了這一點，D-PC組看起來更飽滿，而D-N組顯示出明顯的空洞(圖4c)。  

圖4支架在帕爾馬豬膝關(guān)節(jié)模型中的支架電輸出及骨軟骨缺損修復(fù)效果體內(nèi)測試

通過病理切片及染色（H&E、阿新藍(lán)、番紅O/固綠）比較各組修復(fù)效果。圖4g中軟骨層從上至下排列為D-N、D-C、D-P、D-PC組，修復(fù)效果由纖維組織填充到新生軟骨形成逐漸改善。同樣，軟骨下骨的修復(fù)也由空洞進展到小梁有序修復(fù)，證明了壓電導(dǎo)電支架在大型動物中的有效修復(fù)作用。Seller評分和Wakitani評分進一步證實了修復(fù)效果的差異，D-PC組效果最好，其次是D-P組，再次是D-C組，D-N組修復(fù)效果最差（圖4h、i）。這些在體實驗凸顯了壓電導(dǎo)電支架優(yōu)越的修復(fù)能力。  

5.納米壓痕測試和重建骨軟骨ECM的各向異性特征

6個月后取樣，進行納米壓痕試驗，分析修復(fù)軟骨的表面平整度和力學(xué)性能。。D-PC組結(jié)果最佳，表面圓潤光滑，峰間間隙很小，與正常軟骨非常相似（圖5a）。隨后，將正常軟骨的彈性模量(Er)和硬度值與四個實驗組進行了比較。D-N 組和 D-C組的力學(xué)性能明顯較差，僅為正常軟骨的1-5%。D-P組的Er和硬度值顯著高于D-N組和DC組。然而，這些值顯著低于D-PC組（圖5b、c）。

根據(jù)天然軟骨結(jié)構(gòu)，選擇了兩個單獨的感興趣區(qū)域(ROI)進行分析，圖5d總結(jié)了有關(guān)膠原纖維取向的定量結(jié)果，在底部區(qū)域觀察到了類似的趨勢（圖5e）。為了更好地說明這些趨勢，作者將結(jié)果繪制在極坐標(biāo)圖中，證實D-PC組表現(xiàn)出最有利的膠原纖維排列和整體修復(fù)結(jié)果（圖5f）。這與總體實驗觀察和細(xì)胞預(yù)期相一致，強調(diào)了壓電導(dǎo)電支架在生物醫(yī)學(xué)修復(fù)應(yīng)用中的潛力。    

圖5 術(shù)后6個月不同組修復(fù)組織膠原纖維排列的納米壓痕測試和定量分析

為了模擬人體正常運動過程中的電生理現(xiàn)象，本文設(shè)計了一種壓電導(dǎo)電水凝膠支架。體外實驗表明，該支架具有良好的生物相容性，能顯著促進細(xì)胞遷移和成軟骨/成骨分化。通過RNA測序技術(shù)識別了力電刺激對上下層關(guān)鍵靶分子的影響，為后續(xù)研究奠定了基礎(chǔ)。大型動物體內(nèi)植入實驗表明，該支架通過下層導(dǎo)電層的設(shè)計滿足了骨區(qū)高電輸出的需求，在表面積累正電荷，吸引干細(xì)胞遷移，增強軟骨修復(fù)效果。值得注意的是，在患有骨軟骨缺損的帕爾馬豬模型中，該支架獲得了良好的修復(fù)效果，展示了其臨床治療潛力。    

文章來源：https://doi.org/10.1002/adma.202409400