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剛剛，北京藥監(jiān)局發(fā)布《北京市聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室檢查指南（2024版）（征求意見稿）》，內(nèi)容如下：

 

北京市聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室檢查指南（2024版）

（征求意見稿）

 

聚合酶鏈反應(yīng)檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室是指通過基因擴(kuò)增的方式檢測特定的DNA或RNA的檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室。聚合酶鏈反應(yīng)（Polymerase Chain Reaction，PCR）是一種在體外特異性擴(kuò)增靶DNA序列的技術(shù)，其基本過程為模板雙鏈DNA的變性、引物與模板DNA的退火和在DNA聚合酶引導(dǎo)下的鏈延伸反應(yīng)三個(gè)階段的多次循環(huán)。每一次循環(huán)后的擴(kuò)增產(chǎn)物均可作為下一輪循環(huán)的模板，理論上，擴(kuò)增產(chǎn)物量呈指數(shù)形式上升，即經(jīng)過n個(gè)循環(huán)后，產(chǎn)物量增加到2n倍。PCR試劑操作簡單，短時(shí)間內(nèi)在體外可獲得數(shù)百萬個(gè)特異靶DNA序列的復(fù)制，為臨床疾病的診斷、治療監(jiān)測和預(yù)后評估提供了一種極有幫助的實(shí)驗(yàn)室輔助手段。

PCR檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室是PCR試劑生產(chǎn)企業(yè)在產(chǎn)品檢驗(yàn)過程中不可缺少的工作環(huán)境，其環(huán)境控制水平和質(zhì)量管理水平直接影響著最終產(chǎn)品是否合格，能否放行。由于該產(chǎn)品本身的特殊性，《醫(yī)療器械生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范附錄體外診斷試劑》、《醫(yī)療器械生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范體外診斷試劑現(xiàn)場檢查指導(dǎo)原則》條款中，對PCR試劑的生產(chǎn)和檢驗(yàn)環(huán)境做出明確規(guī)定。此外現(xiàn)行衛(wèi)生行業(yè)的法規(guī)、標(biāo)準(zhǔn)以及相關(guān)文獻(xiàn)中對于PCR檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室均作出規(guī)定，主要涉及《全國臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》（第四版）、《醫(yī)療機(jī)構(gòu)臨床基因擴(kuò)增管理辦法》（衛(wèi)辦醫(yī)政發(fā)〔2010〕194號）、《醫(yī)療機(jī)構(gòu)臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室工作導(dǎo)則》及《臨床診斷中聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）技術(shù)的應(yīng)用》（WS/T 230-2002）等行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)的相關(guān)要求。

本檢查指南旨在幫助北京市醫(yī)療器械監(jiān)管人員增強(qiáng)對PCR檢驗(yàn)相關(guān)過程的認(rèn)知和把握，指導(dǎo)全市醫(yī)療器械監(jiān)管人員對PCR檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)建設(shè)與質(zhì)量控制的監(jiān)督檢查工作。同時(shí)，為PCR試劑生產(chǎn)企業(yè)在PCR檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室的設(shè)計(jì)建造和管理要求提供參考。

本指南中涉及或引用的國家相關(guān)法律、法規(guī)、規(guī)章、標(biāo)準(zhǔn)、檢查指南等發(fā)生內(nèi)容或效力變化時(shí)，要以當(dāng)時(shí)執(zhí)行的最新版為準(zhǔn)。必要時(shí)，北京市藥品監(jiān)督管理局應(yīng)重新研究修訂，以確保本指南持續(xù)符合要求。

 

一、適用范圍

本檢查指南可作為北京市藥品監(jiān)督管理局組織、實(shí)施的體外診斷試劑產(chǎn)品注冊質(zhì)量管理體系現(xiàn)場核查、醫(yī)療器械生產(chǎn)許可現(xiàn)場檢查、醫(yī)療器械生產(chǎn)監(jiān)督檢查等涉及PCR檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室檢查的參考資料。

基因測序檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室等涉及PCR試劑的相關(guān)部分應(yīng)當(dāng)參照本檢查指南執(zhí)行。

 

二、檢查要點(diǎn)

（一）現(xiàn)場查看生產(chǎn)企業(yè)PCR檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室布局

生產(chǎn)企業(yè)應(yīng)當(dāng)提供PCR檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)方案和/或平面設(shè)計(jì)圖（應(yīng)當(dāng)標(biāo)明風(fēng)向或壓差梯度）。

1.PCR檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室與PCR試劑生產(chǎn)區(qū)域應(yīng)當(dāng)在各自獨(dú)立的建筑物或空間內(nèi)，保證空氣不直接連通，防止擴(kuò)增時(shí)形成的氣溶膠造成交叉污染。

2.原則上PCR檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室應(yīng)當(dāng)設(shè)置以下區(qū)域：試劑儲(chǔ)存和準(zhǔn)備區(qū)、標(biāo)本制備區(qū)、擴(kuò)增區(qū)、擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)。根據(jù)使用儀器的功能，區(qū)域可適當(dāng)合并。若使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀且不需要進(jìn)行后續(xù)產(chǎn)物分析工作，擴(kuò)增區(qū)、擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)可合并。若使用樣本處理、核酸提取及擴(kuò)增檢測為一體的自動(dòng)化分析儀，則標(biāo)本制備區(qū)、擴(kuò)增區(qū)、擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)可合并。合并的區(qū)域建議參考擴(kuò)增區(qū)或擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)要求進(jìn)行條件控制。

3.各區(qū)域在物理空間上應(yīng)當(dāng)完全相互獨(dú)立，各區(qū)域無論是在空間上還是在使用中，應(yīng)當(dāng)始終處于完全的分隔狀態(tài)。不應(yīng)當(dāng)只是形式上的分區(qū)，不應(yīng)當(dāng)是一個(gè)區(qū)域嵌套一個(gè)區(qū)域。

4.各區(qū)域不應(yīng)當(dāng)有空氣的直接相通。擴(kuò)增區(qū)與擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)各區(qū)域宜采用獨(dú)立直排方式出風(fēng)。采用空調(diào)機(jī)組方式的，PCR檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室應(yīng)當(dāng)具備獨(dú)立空調(diào)機(jī)組；同時(shí)應(yīng)當(dāng)考慮停機(jī)后各房間空氣連通的可能性，采取必要的控制措施。

5.按照試劑儲(chǔ)存和準(zhǔn)備區(qū)→標(biāo)本制備區(qū)→擴(kuò)增區(qū)→擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)方向空氣壓力應(yīng)當(dāng)以遞減的方式進(jìn)行，使得PCR檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室的空氣流向應(yīng)當(dāng)按照試劑儲(chǔ)存和準(zhǔn)備區(qū)→標(biāo)本制備區(qū)→擴(kuò)增區(qū)→擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)方向進(jìn)行，防止擴(kuò)增產(chǎn)物順空氣氣流進(jìn)入擴(kuò)增前的區(qū)域?？諝饬飨驊?yīng)當(dāng)為單向，禁止下游污染上游。應(yīng)當(dāng)設(shè)置合理的壓差梯度，并安裝壓差監(jiān)測裝置，以有效證明空氣流向，壓差梯度不宜低于5帕。PCR檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室建設(shè)可參考附件進(jìn)行設(shè)計(jì)。

6.設(shè)置緩沖間的，緩沖間內(nèi)通向?qū)嶒?yàn)室和走廊的門應(yīng)當(dāng)安裝互鎖裝置或采取相應(yīng)措施，避免出現(xiàn)兩個(gè)門同時(shí)打開的情況。

7.各區(qū)間若設(shè)置傳遞窗，應(yīng)當(dāng)為雙側(cè)開門，要求密封嚴(yán)實(shí)，并且兩側(cè)的門應(yīng)當(dāng)為互鎖裝置或采取相應(yīng)措施確保兩側(cè)門不會(huì)同時(shí)開啟。同時(shí)應(yīng)當(dāng)考慮各區(qū)間的空氣不會(huì)通過傳遞窗互串。

（二）現(xiàn)場查看儀器設(shè)施配置

1.試劑儲(chǔ)存和準(zhǔn)備區(qū)的功能：儲(chǔ)存試劑的制備、試劑的分裝和擴(kuò)增反應(yīng)混合液的準(zhǔn)備，以及離心管、吸頭等消耗品的貯存和準(zhǔn)備。配套用品一般應(yīng)當(dāng)包括：

（1）符合試劑儲(chǔ)存溫度要求的冰箱；

（2）混勻器；

（3）離心機(jī)；

（4）水浴箱或加熱模塊；

（5）微量加樣器；

（6）紫外消毒設(shè)備；

（7）消耗品：一次性手套、一次性口罩、一次性帽子、耐高壓處理和（或）一次性的離心管和加樣器吸頭；

（8）專用工作服和工作鞋（套）；

（9）專用辦公用品。

2.標(biāo)本制備區(qū)的功能：核酸（RNA、DNA）提取、貯存及加樣。配套用品一般應(yīng)當(dāng)包括：

（1）符合試劑儲(chǔ)存溫度要求的冰箱；

（2）高速離心機(jī)；

（3）混勻器；

（4）水浴箱或加熱模塊；

（5）微量加樣器；

（6）紫外消毒設(shè)備；

（7）生物安全柜；

（8）核酸自動(dòng)提取儀；

（9）消耗品：一次性手套、一次性口罩、一次性帽子、耐高壓處理和（或）一次性的離心管和加樣器吸頭（帶濾芯）；

（10）專用工作服和工作鞋（套）；

（11）專用辦公用品；

（12）如需處理大分子DNA，應(yīng)當(dāng)具有超聲波儀。

3.擴(kuò)增區(qū)的功能：cDNA合成、DNA擴(kuò)增及檢測。配套用品一般應(yīng)當(dāng)包括：

（1）核酸擴(kuò)增儀；

（2）離心機(jī)；

（3）紫外消毒設(shè)備；

（4）消耗品：一次性手套、一次性口罩、一次性帽子、耐高壓處理和（或）一次性的離心管和加樣器吸頭（帶濾芯）；

（5）專用工作服和工作鞋（套）；

（6）專用辦公用品。

4.擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)的功能：擴(kuò)增片段的進(jìn)一步分析測定。視檢驗(yàn)方法不同而定，基本配置如下：

（1）分析設(shè)備；

（2）微量加樣器；

（3）紫外消毒設(shè)備；

（4）冰箱；

（5）消耗品：一次性手套、一次性口罩、一次性帽子、加樣器吸頭（帶濾芯）；

（6）專用工作服和工作鞋（套）；

（7）專用辦公用品。

上述各區(qū)域儀器設(shè)備配備為基本配備，實(shí)驗(yàn)室應(yīng)當(dāng)根據(jù)使用的擴(kuò)增檢測技術(shù)或試劑的特點(diǎn)，對儀器設(shè)備進(jìn)行必要的增減。

5.設(shè)備的維護(hù)保養(yǎng)

應(yīng)當(dāng)建立設(shè)備維護(hù)保養(yǎng)規(guī)程，計(jì)量設(shè)備應(yīng)當(dāng)定期檢定或校準(zhǔn)。例如核酸擴(kuò)增儀、微量加樣器、生物安全柜應(yīng)當(dāng)每年進(jìn)行檢定或校準(zhǔn)工作。

（三）現(xiàn)場檢查工作流程及注意事項(xiàng)

1.單次實(shí)驗(yàn)進(jìn)入各工作區(qū)域應(yīng)當(dāng)嚴(yán)格按照單一方向進(jìn)行，即試劑儲(chǔ)存和準(zhǔn)備區(qū)→標(biāo)本制備區(qū)→擴(kuò)增區(qū)→ 擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)。

2.各工作區(qū)域必須有明確的標(biāo)記，不同工作區(qū)域內(nèi)的設(shè)備、物品不得混用。

3.不同工作區(qū)域的工作服應(yīng)當(dāng)加以區(qū)分，不得混用（例如可以采用不同顏色）。

4.實(shí)驗(yàn)室的清潔應(yīng)當(dāng)按照試劑儲(chǔ)存和準(zhǔn)備區(qū)→標(biāo)本制備區(qū)→擴(kuò)增區(qū)→擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)的方向進(jìn)行。不同的實(shí)驗(yàn)區(qū)域應(yīng)當(dāng)有其各自的清潔用具并防止交叉污染。實(shí)驗(yàn)垃圾屬于醫(yī)療廢物的應(yīng)當(dāng)按照《醫(yī)療廢物管理?xiàng)l例》相關(guān)規(guī)定進(jìn)行處理。

5.工作結(jié)束后，應(yīng)當(dāng)立即對工作區(qū)進(jìn)行清潔及消毒。

6.儲(chǔ)存試劑和用于標(biāo)本制備的消耗品等材料應(yīng)當(dāng)直接運(yùn)送至試劑儲(chǔ)存和準(zhǔn)備區(qū)，不能經(jīng)過擴(kuò)增檢測區(qū)及擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)。應(yīng)當(dāng)對加樣吸頭、PCR反應(yīng)管等消耗品進(jìn)行處理，防止污染。試劑盒中的陽性對照品和（或）質(zhì)控品應(yīng)當(dāng)保存在標(biāo)本制備區(qū)。試劑應(yīng)當(dāng)使用分子生物學(xué)級別試劑，溶劑不應(yīng)當(dāng)對產(chǎn)品檢驗(yàn)造成干擾。質(zhì)檢用于原輔料、半成品、成品檢驗(yàn)用的PCR反應(yīng)試劑應(yīng)當(dāng)有相應(yīng)的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)及操作程序。

7.為避免樣本間的交叉污染，加入待測核酸后，應(yīng)當(dāng)蓋好含反應(yīng)混合液的反應(yīng)管。應(yīng)當(dāng)注意PCR反應(yīng)液加樣的順序，一般應(yīng)當(dāng)先加陰性物質(zhì)后加陽性物質(zhì)。對具有潛在傳染危險(xiǎn)性的材料，應(yīng)當(dāng)在生物安全柜內(nèi)開蓋，并有明確的樣本處理和滅活程序。

8.應(yīng)當(dāng)避免氣溶膠所致的污染，盡量減少在不同區(qū)域內(nèi)的走動(dòng)，擴(kuò)增反應(yīng)管不得在擴(kuò)增區(qū)打開。

9.擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)有可能存在某些可致基因突變和有毒物質(zhì)如溴化乙錠、丙烯酰胺、甲醛或放射性核素等，應(yīng)當(dāng)注意實(shí)驗(yàn)人員的安全防護(hù)，必要時(shí)配備通風(fēng)櫥等防護(hù)設(shè)備。

（四）現(xiàn)場檢查人員培訓(xùn)情況

參與PCR檢驗(yàn)的工作人員應(yīng)當(dāng)具備相應(yīng)的專業(yè)知識和技能，包括能熟練操作相關(guān)設(shè)備，明確整個(gè)工作的流程，掌握出現(xiàn)污染情況的處理方法以及實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制方法和檢測結(jié)果的解釋。

檢查人員可以通過詢問或要求人員實(shí)際操作對其進(jìn)行評價(jià)，也可以通過查閱人員培訓(xùn)記錄，對其進(jìn)行評價(jià)。

（五）現(xiàn)場檢查文件情況

在檢查過程中應(yīng)當(dāng)特別注意現(xiàn)場查看、詢問、記錄的實(shí)際情況與生產(chǎn)企業(yè)的文件規(guī)定、記錄的符合性。

 

附1

理想的PCR檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)

圖A  緩沖間為負(fù)壓的理想PCR檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室設(shè)置模式

 

圖B 緩沖間為正壓的理想PCR檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室設(shè)置模式

圖A和圖B所給出的PCR檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室設(shè)置圖是較為理想的設(shè)置模式，建議企業(yè)參照此種模式設(shè)計(jì)并建立實(shí)驗(yàn)室。

 

附2

 

參考資料

1.《關(guān)于發(fā)布醫(yī)療器械生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范的公告》（國家食品藥品監(jiān)督管理總局公告2014年第64號）

2.《關(guān)于發(fā)布醫(yī)療器械生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范附錄體外診斷試劑的公告》（國家食品藥品監(jiān)督管理總局公告2015年第103號）

3.《關(guān)于印發(fā)醫(yī)療器械生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范現(xiàn)場檢查指導(dǎo)原則等4個(gè)指導(dǎo)原則的通知》（食藥監(jiān)械監(jiān)〔2015〕218號）

4.《生物安全實(shí)驗(yàn)室建筑技術(shù)規(guī)范》（GB 50346-2011）

5.《實(shí)驗(yàn)室生物安全通用要求》（GB 19489-2008）

6.《臨床診斷中聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）技術(shù)的應(yīng)用》（WS/T 203-2002）

7.全國臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程[第4版]

 

附件2

 

《北京市聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室檢查指南（2024版）》修訂說明

 

為了貫徹落實(shí)《醫(yī)療器械生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范》及相關(guān)配套文件要求，加強(qiáng)北京市醫(yī)療器械生產(chǎn)科學(xué)監(jiān)管，指導(dǎo)和規(guī)范北京市醫(yī)療器械生產(chǎn)企業(yè)監(jiān)督檢查工作，幫助檢查人員增強(qiáng)對聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室檢查要點(diǎn)的認(rèn)識和掌握，明確對企業(yè)聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室的基本要求，北京市藥監(jiān)局結(jié)合相關(guān)法規(guī)及標(biāo)準(zhǔn)變化情況，以及北京市監(jiān)管工作實(shí)際，組織對《聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室檢查要點(diǎn)指南（2016版）》進(jìn)行了修訂。

一、修訂背景

原北京市食品藥品監(jiān)督管理局組織編制了《聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室檢查要點(diǎn)指南（2016版）》，旨在幫助北京市醫(yī)療器械監(jiān)管人員增強(qiáng)對PCR檢驗(yàn)相關(guān)過程的認(rèn)知和把握，指導(dǎo)全市醫(yī)療器械監(jiān)管人員對PCR檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)建設(shè)與質(zhì)量控制的監(jiān)督檢查工作。同時(shí)，為PCR試劑生產(chǎn)企業(yè)在PCR檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室的設(shè)計(jì)建造和管理要求提供參考。

為進(jìn)一步落實(shí)新版醫(yī)療器械生產(chǎn)監(jiān)管法規(guī)和相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)要求，我局于今年組織開展對《聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室檢查要點(diǎn)指南（2016版）》進(jìn)行了修訂，結(jié)合相關(guān)法規(guī)及標(biāo)準(zhǔn)變化，以及本市醫(yī)療器械監(jiān)管人員的監(jiān)管實(shí)踐，進(jìn)一步指導(dǎo)相關(guān)醫(yī)療器械生產(chǎn)企業(yè)做好PCR檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室的管理工作。

二、修訂思路

　結(jié)合相關(guān)法規(guī)、標(biāo)準(zhǔn)要求的變化，以及北京市PCR檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室的監(jiān)管實(shí)際，對原指南有關(guān)內(nèi)容進(jìn)一步修改完善，有效落實(shí)醫(yī)療器械法規(guī)、標(biāo)準(zhǔn)要求，對北京市PCR檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室相關(guān)監(jiān)管工作進(jìn)行科學(xué)指導(dǎo)，全力提升科學(xué)監(jiān)管工作水平。

三、主要修訂內(nèi)容

此次修訂，主要對以下內(nèi)容進(jìn)行了修改和完善：

（一）法規(guī)和標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)容的更新

對原指南中已作廢或更新的法規(guī)和標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行更新，如將《生物安全實(shí)驗(yàn)室建筑技術(shù)規(guī)范》（GB 50346-2004）更新為《生物安全實(shí)驗(yàn)室建筑技術(shù)規(guī)范》（GB 50346-2011），將《全國臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》[第3版]更新為《全國臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》[第4版]。

（二）結(jié)合監(jiān)管實(shí)踐對指南內(nèi)容進(jìn)行完善

結(jié)合近年來醫(yī)療器械生產(chǎn)監(jiān)管人員在對PCR實(shí)驗(yàn)室監(jiān)督檢查過程中的實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)進(jìn)行梳理和分析，并在指南中進(jìn)行了完善。如對不同功能區(qū)域的儀器設(shè)施配置進(jìn)行了補(bǔ)充和完善，將“溫度調(diào)控范圍為2℃～8℃和（或）-20℃以下冰箱”調(diào)整為“符合試劑儲(chǔ)存溫度要求的冰箱”，標(biāo)本制備區(qū)新增了“核酸自動(dòng)提取儀”，擴(kuò)增區(qū)刪除“微量加樣器”等，并明確企業(yè)應(yīng)當(dāng)根據(jù)使用的擴(kuò)增檢測技術(shù)或試劑的特點(diǎn)，對儀器設(shè)備進(jìn)行必要的增減，以提高本指南的適用性和可操作性。