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1、毛細(xì)管電泳技術(shù)簡(jiǎn)介

 

1.1  定義：

毛細(xì)管電泳（Capillary Electrophoresis, CE），也可以稱之為高效毛細(xì)管電泳（HPCE），是利用毛細(xì)管為被測(cè)物的分離場(chǎng)所，高壓直流電場(chǎng)為被測(cè)物驅(qū)動(dòng)力，根據(jù)樣品間組分淌度和它們之間分配行為的不同，從而使其得到分離的一種液相分離技術(shù)，是將傳統(tǒng)電泳技術(shù)與現(xiàn)代微柱分離技術(shù)結(jié)合起來(lái)，在20世紀(jì)80年代迅速發(fā)展起來(lái)的又一可以同氣相色譜和高效液相色譜相提并論的分離分析技術(shù)。

 

儀器結(jié)構(gòu)組成：高壓電源、毛細(xì)管柱、緩沖液池、進(jìn)樣系統(tǒng)、檢測(cè)器以及數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)等。

 

分離原理：利用毛細(xì)管為被測(cè)物的分離場(chǎng)所，高壓直流電場(chǎng)為被測(cè)物驅(qū)動(dòng)力，根據(jù)樣品間組分淌度和它們之間分配行為的不同，從而使其得到分離。

 

1.2  特點(diǎn)：

毛細(xì)管電泳通常使用內(nèi)徑為25-100 μm 的彈性（聚酰亞胺）涂層熔融石英管。標(biāo)準(zhǔn)毛細(xì)管的外徑為375 μm，有些管的外徑為160 μm。毛細(xì)管的特點(diǎn)是：容積?。ㄒ桓?00 cm×75 μm 管子的容積僅4.4 μL）；側(cè)面/截面積比大，因而散熱快、可承受高電場(chǎng)（100-1000 V/cm）；可使用自由溶液、凝膠等為支持介質(zhì)；在溶液介質(zhì)下能產(chǎn)生平面形狀的電滲流。

 

由此，可使毛細(xì)管電泳具備如下優(yōu)點(diǎn)：

 

  （1）高效塔板數(shù)目在105-106片/m間，當(dāng)采用CGE時(shí)毛細(xì)管電泳色譜圖，塔板數(shù)目可達(dá)107片/m以上；

 

  （2）快速一般在十幾分鐘內(nèi)完成分離；

 

  （3）微量進(jìn)樣所需的樣品體積為nL級(jí)；

 

  （4）多模式可根據(jù)需要選用不同的分離模式且僅需一臺(tái)儀器；

 

  （5）經(jīng)濟(jì)實(shí)驗(yàn)消耗不過(guò)幾毫升緩沖溶液，維持費(fèi)用很低；

 

  （6）自動(dòng)CE是目前自動(dòng)化程度較高的分離方法。

 

毛細(xì)管電泳的缺點(diǎn)是：

 

  （1）由于進(jìn)樣量少，因而制備能力差；

 

  （2）由于毛細(xì)管直徑小，使光路太短，用一些檢測(cè)方法（如紫外吸收光譜法）時(shí)，靈敏度較低；

 

  （3）電滲會(huì)因樣品組成而變化，進(jìn)而影響分離重現(xiàn)性。

 

 1.3  儀器系統(tǒng)

  毛細(xì)管電泳系統(tǒng)的基本結(jié)構(gòu)包括進(jìn)樣系統(tǒng)、兩個(gè)緩沖液槽、高壓電源、檢測(cè)器、控制系統(tǒng)和數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)。

 

圖1  毛細(xì)管電泳裝置示意圖

 

由于毛細(xì)管內(nèi)徑的限制，檢測(cè)信號(hào)是CE系統(tǒng)最突出的問(wèn)題，CE常用檢測(cè)器：

 

    （1）UV: 常用，但易受到儀器、單波長(zhǎng)等因素的限制；

 

    （2）二極管陣列（PDA）檢測(cè)器：應(yīng)用最廣泛；

 

    （3）激光光熱（LIP）：常規(guī)高敏；

 

    （4）熒光（FL）檢測(cè)器：常規(guī)高敏；

 

    （5）激光誘導(dǎo)熒光（LIF）：近年新產(chǎn)生

 

    （6）安培（EC）：選擇性良好

 

    （7）電導(dǎo)（CD）：通用性很好

 

    （8）質(zhì)譜（MS）：通用性很好，可以獲得結(jié)構(gòu)信息

 

除了電感耦合等離子體（ICP）和紅外（IR）技術(shù)沒(méi)有和CE聯(lián)用，其他的檢測(cè)方法均和CE聯(lián)用并且大部分實(shí)現(xiàn)商品化。

 

使用CE時(shí)應(yīng)該根據(jù)所分析物質(zhì)的特點(diǎn)，選擇相應(yīng)分離模式和檢測(cè)器，以揚(yáng)長(zhǎng)避短，得到最佳分析效果。

 

毛細(xì)管電泳儀的主要部件和其性能要求如下。

 

  （1）毛細(xì)管用彈性石英毛細(xì)管，內(nèi)徑50μm和75μm兩種使用較多（毛細(xì)管電色譜有時(shí)用內(nèi)徑再大些的毛細(xì)管）。細(xì)內(nèi)徑分離效果好，且焦耳熱小，允許施加較高電壓，但若采用柱上檢測(cè)因光程較短檢測(cè)限比較粗內(nèi)徑管要差。毛細(xì)管長(zhǎng)度稱為總長(zhǎng)度，根據(jù)分離度的要求，可選用20～100cm長(zhǎng)度，進(jìn)樣端至檢測(cè)器間的長(zhǎng)度稱為有效長(zhǎng)度。毛細(xì)管常盤放在管架上控制在一定溫度下操作，以控制焦耳熱，操作緩沖液的黏度和電導(dǎo)度，對(duì)測(cè)定的重復(fù)性很重要。

 

  （2）直流高壓電源采用0～30kV（或相近）可調(diào)節(jié)直流電源，可供應(yīng)約300μA電流，具有穩(wěn)壓和穩(wěn)流兩種方式可供選擇。

 

  （3）電極和電極槽兩個(gè)電極槽里放入操作緩沖液，分別插入毛細(xì)管的進(jìn)口端與出口端以及鉑電極，鉑電極接至直流高壓電源，正負(fù)極可切換。多種型號(hào)的儀器將樣品瓶同時(shí)用做電極槽。

 

  （4）沖洗進(jìn)樣系統(tǒng)每次進(jìn)樣之前毛細(xì)管要用不同溶液沖洗，選用自動(dòng)沖洗進(jìn)樣儀器較為方便。進(jìn)樣方法有壓力（加壓）進(jìn)樣、負(fù)壓（減壓）進(jìn)樣、虹吸進(jìn)樣和電動(dòng)（電遷移）進(jìn)樣等。進(jìn)樣時(shí)通過(guò)控制壓力或電壓及時(shí)間來(lái)控制進(jìn)樣量。

 

  （5）檢測(cè)系統(tǒng)紫外-可見(jiàn)光分光檢測(cè)、激光誘導(dǎo)熒光檢測(cè)、電化學(xué)檢測(cè)和質(zhì)譜檢測(cè)均可用作毛細(xì)管電泳的檢測(cè)器。

 

其中以紫外-可見(jiàn)光分光光度檢測(cè)器應(yīng)用最廣，包括單波長(zhǎng)、程序波長(zhǎng)和二極管陣列檢測(cè)器。將毛細(xì)管接近出口端的外層聚合物剝?nèi)ゼs2mm一段，使石英管壁裸露，毛細(xì)管兩側(cè)各放置一個(gè)石英聚光球，使光源聚焦在毛細(xì)管上，透過(guò)毛細(xì)管到達(dá)光電池。對(duì)無(wú)光吸收（或熒光）的溶質(zhì)的檢測(cè)，還可采用間接測(cè)定法，即在操作緩沖液中加入對(duì)光有吸收（或熒光）的添加劑，在溶質(zhì)到達(dá)檢測(cè)窗口時(shí)出現(xiàn)反方向的峰。

 

  （6）數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)與一般色譜數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)基本相同。

 

1.4  影響分離的因素

1.4.1 緩沖液

緩沖試劑的選擇主要由所需的pH決定，在相同的pH下，不同緩沖試劑的分離效果不盡相同，有的可能相差甚遠(yuǎn)。

 

CE中常用的緩沖試劑有：磷酸鹽、硼砂或硼酸、醋酸鹽等。

緩沖鹽的濃度直接影響到電泳介質(zhì)的離子強(qiáng)度，從而影響Zeta電勢(shì)，而Zeta電勢(shì)的變化又會(huì)影響到電滲流。緩沖液濃度升高，離子強(qiáng)度增加，雙電層厚度減小，Zeta電勢(shì)降低，電滲流減小，樣品在毛細(xì)管中停留時(shí)間變長(zhǎng)，有利于遷移時(shí)間短的組分的分離，分析效率提高。同時(shí)，隨著電解液濃度的提高，電解液的電導(dǎo)將大大高于樣品溶液的電導(dǎo)而使樣品在毛細(xì)管柱上產(chǎn)生堆積的效果，增強(qiáng)樣品的富集現(xiàn)象，增加樣品的容量，從而提高分析靈敏度。但是，電解液濃度太高，電流增大，由于熱效應(yīng)而使樣品組分蜂形擴(kuò)展，分離效果反而變差。此外，離子還可以通過(guò)與管壁作用以及影響溶液的粘度、介電常數(shù)等來(lái)影響電滲，離子強(qiáng)度過(guò)高或過(guò)低都對(duì)提高分離效率不利。

 

1.4.2 pH值

緩沖體系pH的選擇依樣品的性質(zhì)和分離效率而定，是決定分離成敗的一大關(guān)鍵。不同樣品需要不同的pH分離條件，控制緩沖體系的pH值，一般只能改變電滲流的大小。pH能影響樣品的解離能力，樣品在極性強(qiáng)的介質(zhì)中離解度增大，電泳速度也隨之增大，從而影響分離選擇性和分離靈敏度。pH還會(huì)影響毛細(xì)管內(nèi)壁硅醇基的質(zhì)子化程度和溶質(zhì)的化學(xué)穩(wěn)定性，pH在4-10之間，硅醇基的解離度隨pH的升高而升高，電滲流也隨之升高。因此，pH為分離條件優(yōu)化時(shí)不可忽視的因素。

 

1.4.3 分離電壓

在CE中，分離電壓也是控制電滲的一個(gè)重要參數(shù)。高電壓是實(shí)現(xiàn)CE快速、高效的前提，電壓升高，樣品的遷移加大，分析時(shí)間縮短，但毛細(xì)管中焦耳熱增大，基線穩(wěn)定性降低，靈敏度降低；分離電壓越低，分離效果越好，分析時(shí)間延長(zhǎng)，峰形變寬，導(dǎo)致分離效率降低。因此，相對(duì)較高的分離電壓會(huì)提高分離度和縮短分析時(shí)間，但電壓過(guò)高又會(huì)使譜帶變寬而降低分離效率。電解質(zhì)濃度相同時(shí)，非水介質(zhì)中的電流值和焦耳熱均比水相介質(zhì)中小得多，因而在非水介質(zhì)中允許使用更高的分離電壓。

 

1.4.4 溫度

溫度影響分離重現(xiàn)性和分離效率，控制溫度可以調(diào)控電滲流的大小。溫度升高，緩沖液粘度降低，管壁硅輕基解離能力增強(qiáng)，電滲速度變大，分析時(shí)間減短，分析效率提高。但溫度過(guò)高，會(huì)引起毛細(xì)管柱內(nèi)徑向溫差增大，焦耳熱效應(yīng)增強(qiáng)，柱效降低，分離效率也會(huì)降低。

 

1.4.5 添加劑

在電解質(zhì)溶液中加入添加劑，例如中性鹽、兩性離子、表面毛細(xì)管活性劑以及有機(jī)溶劑等，會(huì)引起電滲流的顯著變化。表面活性劑常用作電滲流的改性劑，通過(guò)改變濃度來(lái)控制電滲流的大小和方向，但當(dāng)表面活性劑的濃度高于臨界膠束濃度時(shí)，將形成膠束。加入有機(jī)溶劑會(huì)降低離子強(qiáng)度，Zeta電勢(shì)增大，溶液粘度降低，改變管壁內(nèi)表面電荷分布，使電滲流降低。在電泳分析中，緩沖液一般用水配制，但用水一有機(jī)混合溶劑常常能有效改善分離度或分離選擇性。

 

1.4.6 進(jìn)樣

CE的常規(guī)進(jìn)樣方式有兩種：流體力學(xué)和電遷移進(jìn)樣。

 

電遷移進(jìn)樣是在電場(chǎng)作用下，依靠樣品離子的電遷移和（或）電滲流將樣品注入，故會(huì)產(chǎn)生電歧視現(xiàn)象，會(huì)降低分析的準(zhǔn)確性和可靠性，但此法尤其適用于粘度大的緩沖液和CGE情況。

 

流體力學(xué)進(jìn)樣是普適方法，可以通過(guò)虹吸、在進(jìn)樣端加壓或檢測(cè)器端抽空等方法來(lái)實(shí)現(xiàn)，但選擇性差，樣品及其背景同時(shí)被引入毛細(xì)管，對(duì)后續(xù)分離可能產(chǎn)生影響。通過(guò)進(jìn)樣時(shí)間也可以來(lái)改善分離效果，進(jìn)樣時(shí)間過(guò)短，峰面積太小，分析誤差大。進(jìn)樣時(shí)間過(guò)大，樣品超載，進(jìn)樣區(qū)帶擴(kuò)散，會(huì)引起峰之間的重疊，與提高分離電壓一樣，分離效果變差。

 

另外，毛細(xì)管電泳技術(shù)的高分離性能以及消耗試劑少等特點(diǎn)使其分析領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用，但是其常規(guī)分析的靈敏度不能適應(yīng)痕量分析的要求，限制了它的應(yīng)用和推廣。樣品前處理技術(shù)可以提高樣品通量或?qū)⒑哿糠治鑫镞M(jìn)行預(yù)富集，去除樣品基質(zhì)，將其與毛細(xì)管電泳技術(shù)聯(lián)用不僅可以提高分析的靈敏度，同時(shí)也消除了大部分可能的基質(zhì)干擾，是一種比較理想的富集分離檢測(cè)技術(shù)。

 

常用的有CE-流動(dòng)注射聯(lián)用技術(shù)、固相萃取-CE聯(lián)用技術(shù)、固相微萃取-CE聯(lián)用技術(shù)、液相微萃取-CE聯(lián)用技術(shù)、微透析-CE聯(lián)用技術(shù)和膜萃取-CE聯(lián)用技術(shù)。

 

當(dāng)前毛細(xì)管電泳技術(shù)主要以提高CE的定量準(zhǔn)確性，提高分離效率和擴(kuò)大應(yīng)用范圍為目的，故CE技術(shù)研究主要圍繞新的CE技術(shù)（進(jìn)樣手段和分離模式）、涂層技術(shù)、涂層材料、在線富集技術(shù)、檢測(cè)技術(shù)和新的聯(lián)用接口技術(shù)（CE-MS、CE-MicroTAS）而展開(kāi)。

 

1.5 毛細(xì)管電泳應(yīng)用

CE具有多種分離模式（多種分離介質(zhì)和原理），故具有多種功能，因此其應(yīng)用十分廣泛，通常能配成溶液或懸浮溶液的樣品（除揮發(fā)性和不溶物外）均能用CE進(jìn)行分離和分析，小到無(wú)機(jī)離子，大到生物大分子和超分子，甚至整個(gè)細(xì)胞都可進(jìn)行分離檢測(cè)。它廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)、醫(yī)藥科學(xué)、臨床醫(yī)學(xué)、分子生物學(xué)、法庭與偵破鑒定、化學(xué)、環(huán)境、海關(guān)、農(nóng)學(xué)、生產(chǎn)過(guò)程監(jiān)控、產(chǎn)品質(zhì)檢以及單細(xì)胞和單分子分析等領(lǐng)域。

 

目前，CE分析技術(shù)被藥物分析工作者在藥品檢驗(yàn)領(lǐng)域迅速推廣應(yīng)用。藥物分析大致可以分為兩部分：一、原藥的定量、原藥中雜質(zhì)的測(cè)定、藥劑分析以及對(duì)它們穩(wěn)定性的評(píng)價(jià)等以藥品質(zhì)量管理為目的的測(cè)定方法。這些方法要求有良好的選擇性、適當(dāng)?shù)姆治鲮`敏度和可靠的準(zhǔn)確度等；二、對(duì)進(jìn)入人體內(nèi)的藥物或代謝物的吸收、分布、代謝、排泄等體內(nèi)動(dòng)態(tài)的研究，即臨床藥物分析。這兩部分的測(cè)定一般需要分離和檢測(cè)手段相結(jié)合。

 

2、 毛細(xì)管電泳分類

 

2.1 按毛細(xì)管電泳分離模式分類

 

CE眾多的分離模式是其應(yīng)用廣泛的基礎(chǔ)，在進(jìn)行樣品分離時(shí)通常需要根據(jù)分離目的來(lái)選擇合適的分離模式，以達(dá)到最佳的分離效果。

 

常見(jiàn)的CE分離模式有毛細(xì)管區(qū)帶電泳(CZE)、膠束電動(dòng)毛細(xì)管電泳（MEKC),毛細(xì)管等電聚焦(CIEF)、毛細(xì)管凝膠電泳(CGE)、毛細(xì)管等速電泳(CITP)和毛細(xì)管電色譜（CEC）。CE可以按操作方式分為手動(dòng)、半自動(dòng)和全自動(dòng)三種類型，或按分離通道形狀分為圓形、扁形、方形毛細(xì)管，也可以按表1所示方式進(jìn)行分類[15,32,33]。

 

表2  毛細(xì)管電泳分類

	類型	縮寫	說(shuō)明	原理
1 單根毛細(xì)管	毛細(xì)管區(qū)帶電泳	CZE	毛細(xì)管和電極槽灌有相同的緩沖液	離子電泳淌度差異
	毛細(xì)管等速電泳	CITP	使用兩種不同的CZE 緩沖液	組分淌度差異
	毛細(xì)管等電聚焦	CIEF	管內(nèi)裝pH 梯度介質(zhì)，相當(dāng)于pH 梯度CZE	等電點(diǎn)差異
	膠束電動(dòng)毛細(xì)管色譜	MEKC	在CZE 緩沖液中加入一種或多種膠束	疏水性/離子性差異
	微乳液毛細(xì)管電動(dòng)色譜	MEEKC	在CZE 緩沖液加入水包油乳液高分子離子交換	疏水性/離子性差異
	毛細(xì)管電動(dòng)色譜	PICEC	在CZE 緩沖液中加入可微觀分相的高分子離子	疏水性/離子性差異
	開(kāi)管毛細(xì)管電色譜	OTCEC	使用固定相涂層毛細(xì)管，分正、反相于離子交換	視涂層性質(zhì)而定
	親和毛細(xì)管電泳	ACE	在CZE 緩沖液或管內(nèi)加入親和作用試劑	視親和試劑而定
	非膠毛細(xì)管電泳	NGCE	在CZE 緩沖液中加入高分子構(gòu)成篩分網(wǎng)絡(luò)	視高分子性質(zhì)而定
2 單根填充管	毛細(xì)管凝膠電泳	CGE	管內(nèi)填充凝膠介質(zhì)，用CZE 緩沖液	溶質(zhì)分子尺寸與電荷/質(zhì)量比差異
	聚丙烯酰胺毛細(xì)管凝膠電泳	PA-CGE	管內(nèi)填充聚丙烯酰胺凝膠	電荷/分子大小差異
	瓊脂糖毛細(xì)管凝膠電泳	Agar-CGE	管內(nèi)填充瓊脂糖凝膠	離子交換/氫鍵差異
	填充毛細(xì)管電色譜	PCCEC	毛細(xì)管內(nèi)填充色譜填料，分正、反相于離子交換等	色譜原理
3	陣列毛細(xì)管電泳	CAE	利用一根以上的毛細(xì)管進(jìn)行CE 操作
4	芯片式毛細(xì)管電泳	CCE	利用刻制在載玻片上的毛細(xì)通道進(jìn)行電泳
5 聯(lián)用	毛細(xì)管電泳/質(zhì)譜	CE/MS	常用電噴霧接口，需揮發(fā)性緩沖液
	毛細(xì)管電泳/核磁共振	CE/NMR	需采用停頓式掃描樣品峰的測(cè)定方法
	毛細(xì)管電泳/激光誘導(dǎo)熒光	CE/LIF	具單細(xì)胞、單分子分析潛力

 

2.2 按操作方式分類

毛細(xì)管電泳儀可以按操作方式重新分為手動(dòng)、半自動(dòng)及全自動(dòng)型毛細(xì)管電泳。

 

2.3 按分離通道形狀分類

按分離通道形狀分為圓形、扁形、方形毛細(xì)管電泳等。

 

2.4 按緩沖液的介質(zhì)分類

根據(jù)配制緩沖液的介質(zhì)的不同，可以把CE分為水相毛細(xì)管電泳和非水毛細(xì)管電泳（NACE）。NACE是以有機(jī)溶劑作介質(zhì)的電泳緩沖液代替以水為介質(zhì)的緩沖溶液，增加了疏水性物質(zhì)的溶解度，特別適用于在水溶液中難溶而不能用CE分離的物質(zhì)或在水溶液中性質(zhì)相似難以分離的同系物，拓寬了CE的分析領(lǐng)域。

 

參考來(lái)源：

 

[1]《毛細(xì)管電泳技術(shù)及應(yīng)用（第三版）》，陳義著，化學(xué)化工出版社

 

[2]  毛細(xì)管電泳_百度百科 (baidu.com)