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全球范圍內(nèi)，關(guān)節(jié)軟骨（AC）缺陷是一個常見問題，它們可能在疾病的后期導致關(guān)節(jié)崩潰，因此需要立即干預以防止軟骨的進一步退化。數(shù)十年來對水凝膠在生物醫(yī)學應用的研究揭示了其巨大潛力，特別是在軟組織工程領(lǐng)域，包括關(guān)節(jié)軟骨再生（CR）。水凝膠具有高度可調(diào)性，可以設計滿足CR模板所需的關(guān)鍵標準。

來自德國羅斯托克大學的 Hermann Seitz等團隊綜述了水凝膠設計在CR領(lǐng)域的前沿進展。本文旨在確定這些標準，包括水凝膠成分、機械性能、生物降解性、結(jié)構(gòu)設計和與鄰近原生組織的整合能力，并深入探討通過適當設計CR可以獲得的好處。文章還討論了模擬天然軟骨結(jié)構(gòu)的分層結(jié)構(gòu)水凝膠以及環(huán)境刺激對再生結(jié)果的影響。通過審視最新進展和新興技術(shù)，本文為開發(fā)有效的基于水凝膠的AC修復療法提供了寶貴的見解。相關(guān)工作以題為“Advancements in hydrogel design for articular cartilage regeneration: A comprehensive review”的綜述文章發(fā)表在2024年09月14日的期刊《Bioactive Materials》。

1.創(chuàng)新型研究內(nèi)容

根據(jù)交聯(lián)化學的不同，制造出的水凝膠既可以是可植入的也可以是可注射的（見圖1）?？芍踩氲乃z支架具有顯著的臨床優(yōu)勢，包括高機械強度和可定制的形狀。這些支架通過如3D打印技術(shù)（擠出或直接墨寫（DIW）方法）預制，并在目標部位進行外科植入，展示了在治療應用中的巨大潛力。由于其溶膠-凝膠特性，可注射的水凝膠可以輕松填充軟骨缺陷。這些對溫度或剪切力響應的水凝膠確保了不規(guī)則膝關(guān)節(jié)形狀的適當填充、細胞的均勻分布，并使得可以進行微創(chuàng)手術(shù)。水凝膠的優(yōu)勢在于其可調(diào)性，其屬性可以根據(jù)應用需求進行調(diào)整。

圖1 使用水凝膠進行軟骨組織再生的方法示意圖以及設計用于放置在膝關(guān)節(jié)損傷部位的不同水凝膠

關(guān)鍵參數(shù)，包括材料類型、機械強度、基質(zhì)剛度和彈性、生物降解性、完整性、孔隙率以及互連性，對于調(diào)控細胞命運至關(guān)重要，特別是在增殖和分化方面。這為研究開辟了廣闊的領(lǐng)域，以確定這些因素單獨或相互結(jié)合如何有助于更好地重建組織。然而，關(guān)于這一領(lǐng)域的基本處理參數(shù)的研究卻很少。當前的綜述文章為水凝膠在這一領(lǐng)域的研究提供了不同的視角。本綜述的主要目的是展示設計用于軟骨再生（CR）的水凝膠所涉及的關(guān)鍵因素的最新進展。以下部分涵蓋了水凝膠設計的參數(shù)，包括水凝膠成分、機械性能、生物降解性、結(jié)構(gòu)設計和與相鄰天然組織的整合能力。本文首先全面概述了該領(lǐng)域的現(xiàn)有知識，強調(diào)了基于水凝膠的軟骨組織工程方法的挑戰(zhàn)和局限性。然后探討了水凝膠設計的最新進展和突破，第3節(jié)探討了模仿天然軟骨結(jié)構(gòu)的分層結(jié)構(gòu)水凝膠。接下來是討論環(huán)境刺激以及如何通過闡明水凝膠結(jié)構(gòu)之間的相互作用來設計它們以調(diào)節(jié)細胞反應和組織再生。圖2提供了整個綜述內(nèi)容的全面總結(jié)。本文旨在強調(diào)仿生水凝膠可以恢復關(guān)節(jié)軟骨的組成、結(jié)構(gòu)和生物力學功能。最后通過分享對水凝膠設計用于關(guān)節(jié)軟骨修復未來的看法來結(jié)束本文。這些進步在滿足尚未解決的臨床需求、提高軟骨相關(guān)疾病患者的生活質(zhì)量方面具有重大前景，從而直接影響聯(lián)合國可持續(xù)發(fā)展目標。    

圖2 用于軟骨再生的水凝膠設計中的關(guān)鍵參數(shù)示意圖，包括水凝膠成分、機械性能、生物降解性、孔隙性和連通性以及與鄰近原生組織的整合

【水凝膠成分】

為了確保實際應用中的生物活性和生物相容性，用于水凝膠的聚合物可以來源于生物體內(nèi)的內(nèi)源性物質(zhì)。這些包括糖胺聚糖、大分子蛋白質(zhì)和DNA核苷酸。Zhao等人介紹了具有可調(diào)節(jié)表面硬度的DNA-SF DN水凝膠。這些水凝膠通過DNA堿基配對形成，并通過限制和聚集SF分子促進β-折疊結(jié)構(gòu)的形成。第二網(wǎng)絡是通過酶介導的SF交聯(lián)建立的。研究發(fā)現(xiàn)，DNA-SF DN水凝膠在促進軟骨分化方面非常有效。在此基礎(chǔ)上，Shen等人開發(fā)了能夠裝載BMSCs的RGD-SF-DNA水凝膠微球（RSD-MSs）。首先，使用微流控技術(shù)、絲素甲基丙烯酸酯和超分子DNA水凝膠技術(shù)創(chuàng)建了SF-DNA DN水凝膠微球（SD-MSs）。然后通過光聚合技術(shù)對這些微球進行表面修飾，引入Pep-RGDfKA。結(jié)果表明，RSD-MSs是制造和維護長期軟骨類器官的理想選擇，為CR提供了一個創(chuàng)新的策略和生物材料選擇（圖3A）。  

圖3 用于合成RGD-SF-DNA微球及其在創(chuàng)建軟骨類器官前體和軟骨再生中的應用的示意圖

【機械強度】

天然的關(guān)節(jié)軟骨（AC）具有獨特的機械性能，包括特定的壓縮強度、彈性模量和粘彈性行為。水凝膠支架的機械特性在提供適當?shù)闹С?、負荷分布和功能性方面起著至關(guān)重要的作用，這些都是成功進行CR所必需的。許多研究專注于調(diào)節(jié)水凝膠的機械性能以模擬天然軟骨的特性。與常規(guī)水凝膠不同，關(guān)節(jié)軟骨既堅硬又堅韌，而常規(guī)水凝膠在機械力的作用下會變形，且缺乏軟骨修復所需的必要屬性。更常見的是，通過犧牲吸收和保留凝膠水分的能力來實現(xiàn)硬化過程，這可能會通過阻礙細胞遷移和生物分子擴散來損害嵌入細胞的存活能力。此外，它們的脆性抑制了力分布，降低了潤滑功能。然而，孔徑大小、溶脹比、強度和韌性等參數(shù)可以在不犧牲硬度的情況下得到改善。Gan等人通過將多巴胺甲基丙烯酸酯低聚物摻入GelMA中開發(fā)了一種水凝膠，與單網(wǎng)絡GelMA水凝膠相比，該水凝膠在機械性能上具有兩個關(guān)鍵優(yōu)勢。首先，GelMA鏈之間距離的增加提高了水凝膠的失效應變。其次，多巴胺創(chuàng)建了一個次級交聯(lián)網(wǎng)絡，在負載下通過物理犧牲鍵耗散能量（見圖4A）。當前的努力集中在開發(fā)既能保持硬度又能分散能量以防止在受損區(qū)域集中力量的堅韌水凝膠上。一種有前景的軟骨修復方法涉及使用多種聚合物和交聯(lián)機制，每種都有其特定用途。    

圖4 多巴胺甲基丙烯酸酯及其低聚物（ODMA）的合成

【剛度和彈性】

基質(zhì)彈性可以決定干細胞的命運或譜系承諾。在較硬的基質(zhì)上，MSCs、成纖維細胞和內(nèi)皮細胞都表現(xiàn)出了改善的細胞粘附、擴散和增殖。如前所述，天然凝膠由于其調(diào)整機械性能的能力有限，并不理想用于研究軟骨細胞對需要精確控制剛度的基質(zhì)的力學感應。通過改變交聯(lián)類型、復合材料的濃度比例、外部刺激、分子量以及添加納米顆粒（NPs），研究人員創(chuàng)建了可調(diào)剛度的水凝膠。Kwon和Yasuda開發(fā)了磺酸鹽涂層的聚丙烯酰胺（S-PAAm）凝膠，其彈性模量分別為1, 15和150 kPa。培養(yǎng)在高剛度凝膠上的MSCs顯示出強烈的應力纖維表達，而那些在低剛度凝膠上的細胞則呈現(xiàn)出圓形，具有更多的皮質(zhì)肌動蛋白。值得注意的是，較低剛度的凝膠即使沒有分化補充劑也導致了更高的軟骨生成標記物（Col 2a1, Agc, Sox9）的mRNA水平（圖5A）。Lin等人通過調(diào)整PEG-二丙烯酸酯（PEGDA）前體的分子量從3.4到20 kDa，創(chuàng)建了具有不同機械性能的水凝膠。較高分子量的PEGDA增加了水凝膠的溶脹比和網(wǎng)格大小。PEGDA-6 kDa和-10 kDa水凝膠在第四周時具有最高的糖胺聚糖（GAG）含量，而PEGDA-20 kDa則有更高的膠原蛋白含量。PEGDA-10 kDa顯示出最高的II型膠原過度表達。Schuh等人使用經(jīng)過RGD修飾的瓊脂糖水凝膠獨立研究了基質(zhì)剛度、粘附位點密度和孔隙率的影響。無論基質(zhì)的剛度如何或粘附位點的可用性如何，細胞都保留了軟骨生成表型。通過定量測定發(fā)現(xiàn)，經(jīng)RGD和RGE（精氨酰-甘氨酰-谷氨酰）修飾的較軟凝膠中的GAG和DNA含量顯著更高。然而，每個DNA的GAG含量不受基質(zhì)剛度或粘附位點可用性的影響。根據(jù)蘇木精和伊紅（H&E）染色，較軟凝膠中細胞ECM簇的平均直徑顯著大于較硬凝膠中的直徑（圖5B）。    

圖5 不同剛度S-PAAm凝膠上MSCs中的F-actin結(jié)構(gòu)以及MSCs在PS（對照）和S-PAAm凝膠上1周后的Col 2a1、Agc、Sox9和Sca1基因表達

【孔隙性與連通性】

優(yōu)化水凝膠支架的孔隙性和連通性可以通過多種方法實現(xiàn)。一種方法是犧牲模板法，即將某種材料引入水凝膠中，隨后去除該材料以形成孔隙。例如，Konka等人在羥基磷灰石支架中使用了Gel微球，從而形成了適合組織工程的多孔結(jié)構(gòu)（圖6A）。另一種方法是顆粒瀝濾法，即在水凝膠中分散水溶性顆粒，然后溶解這些顆粒以形成孔隙。此外，還使用PLGA海綿作為模板來創(chuàng)建具有連通孔隙的Col支架。這些支架支持均勻的軟骨細胞分布、快速的細胞分裂以及增加的軟骨基因表達和細胞外基質(zhì)分泌。最有效的結(jié)果是使用高重量比和大鹽顆粒的PLGA海綿作為模板的Col支架（圖6B）。    

圖6 使用DIW技術(shù)開發(fā)分層多孔仿生羥基磷灰石支架

為了創(chuàng)建大孔結(jié)構(gòu)，已經(jīng)開發(fā)了各種其他方法，包括3D打印、凍干法、氣體發(fā)泡、聚合物相分離以及乳化液滴或聚合物微球。在眾多3D生物打印策略中，擠出式打印、噴墨式打印和激光生物打印是最常用的（圖7）。每種方法都有其優(yōu)缺點，例如成本、精度和時間效率。這些標準3D生物打印技術(shù)的主要區(qū)別在于它們對微觀幾何結(jié)構(gòu)的精確控制能力。在打印之前，CAD軟件系統(tǒng)設計3D模型并設置參數(shù)。不同的墨水和方法需要特定的參數(shù)。水凝膠墨水被混合并放置在墨水儲存盒中，然后由3D打印機逐層應用到構(gòu)建平臺上。每一層硬化后，再添加下一層，逐步構(gòu)建起3D水凝膠前體，最后將其連接在一起。然而，在空中打印軟質(zhì)生物材料可能導致變形和形狀喪失。為解決這一問題，自由可逆嵌入懸浮水凝膠（FRESH）技術(shù)在具有屈服應力的支持浴中打印生物墨水，該支持浴在生物墨水固化前將其固定住。該方法涉及將打印的水凝膠嵌入作為臨時性、熱可逆性和生物相容性的第二水凝膠中。

圖7 生物打印步驟和不同打印方法的示意圖

組織發(fā)育的不同階段需要不同的大孔密度和大小。低孔隙度提供結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性并保存移植細胞，而隨著時間的推移增加的孔隙度有助于營養(yǎng)擴散、細胞增殖和基質(zhì)形成。張等人開發(fā)了一種具有膨脹依賴性門控的雙層3D打印支架，其下層孔隙較小，上層基質(zhì)孔隙較大。這種設計允許骨髓MSCs最初浸潤，隨后阻斷過多的血液支持，有助于穩(wěn)定的軟骨生成（圖8A）。可生物降解聚合物可以隨時間增加孔隙度，但控制大孔形成的時機和程度仍然具有挑戰(zhàn)性。現(xiàn)有方法通常使細胞暴露在惡劣條件下，降低存活率。在預制的大孔支架上接種細胞可能導致效率低下和分布不均。使用非細胞毒性成孔劑封裝細胞可以更好地控制細胞分布。韓等人使用刺激響應性成孔劑創(chuàng)建了具有可調(diào)大孔的動態(tài)水凝膠，響應溫度、螯合和酶解等刺激。   

圖8 用于軟骨修復的具有兩種孔徑的雙層支架示意圖

【整合能力】    

可注射水凝膠以其易于給藥和對刺激的響應性而聞名，通過均勻分散細胞和生物分子并填充不規(guī)則的組織缺陷，促進與周圍軟骨的整合。調(diào)整凝膠時間對于強整合至關(guān)重要；它既不應過長以避免材料流動，也不應過短以免影響整合?？勺⑸渌z也用于治療復雜的疾病如骨關(guān)節(jié)炎，其剪切稀化特性防止細胞沉降。Hou等人將脲嘧啶酮(UPy)單元摻入DEX聚合物中，創(chuàng)建了一種剪切稀化的水凝膠，由于動態(tài)氫鍵作用，在幾分鐘內(nèi)就能整合兩種嵌入軟骨細胞和BMSCs的水凝膠（見圖9A）。

圖9 用于多組織復合再生的DEX-UPy水凝膠設計

【總結(jié)與展望】

水凝膠的機械性能，如剛度和彈性，必須與天然軟骨緊密匹配，以有效分配負載并與周圍組織整合。平衡剛度、韌性和彈性是具有挑戰(zhàn)性的，因為改善其中一個往往會犧牲另一個。例如，增加剛度可能會減少水分保持能力，而這對細胞存活至關(guān)重要。需要創(chuàng)新的方法，如多網(wǎng)絡水凝膠或動態(tài)共價鍵，來創(chuàng)建能夠承受關(guān)節(jié)復雜機械環(huán)境的同時支持組織再生的水凝膠。此外，這些材料必須與細胞封裝兼容且無毒。生物降解性也是關(guān)鍵；水凝膠必須以允許結(jié)構(gòu)支持的速率降解，同時逐漸被新的ECM替代。孔隙率和互連性對于細胞浸潤、營養(yǎng)擴散和廢物清除至關(guān)重要，這些都是功能性組織形成所必需的。先進的水凝膠采用策略如酶促降解片段和微腔結(jié)構(gòu)來增強基質(zhì)分布和軟骨細胞增殖。然而，與宿主組織的整合仍是一個主要挑戰(zhàn)，特別是由于軟骨的密集ECM和關(guān)節(jié)的苛刻機械環(huán)境。研究集中在通過生物粘合劑、用吸引細胞成分修改水凝膠以及優(yōu)化孔結(jié)構(gòu)以支持細胞遷移和ECM沉積來改善整合?？朔@些挑戰(zhàn)對于釋放水凝膠在軟骨修復中的全部潛力并確保其成功臨床應用至關(guān)重要。    

文章來源：

https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2452199X2400392X?via%3Dihub