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EdU（5-Ethynyl-2'-deoxyuridine）染色是一種新型的細(xì)胞增殖檢測方法，用于標(biāo)記和檢測處于DNA合成期（S期）的細(xì)胞，以反映細(xì)胞的增殖情況。

一、原理

EdU是一種胸苷類似物，能夠在細(xì)胞的S期被摻入到正在合成的DNA鏈中，取代天然的胸腺嘧啶脫氧核苷（Thymidine）。這意味著EdU只能在細(xì)胞正在進(jìn)行DNA復(fù)制（即處于S期）時(shí)被摻入細(xì)胞的DNA中，因此，EdU的摻入標(biāo)志著細(xì)胞正在增殖。一旦EdU被摻入到DNA中，通過一種稱為“點(diǎn)擊化學(xué)”（Click Chemistry）的銅催化疊氮-炔反應(yīng)，可以將熒光標(biāo)記的疊氮物與EdU中的炔基共價(jià)結(jié)合。

這種反應(yīng)高效、快速，并且在細(xì)胞內(nèi)的非損傷環(huán)境下進(jìn)行。反應(yīng)后，DNA中的EdU就會(huì)帶有熒光標(biāo)記，能夠在熒光顯微鏡或流式細(xì)胞儀下檢測到。通過熒光顯微鏡或流式細(xì)胞儀，研究者可以定量測定EdU摻入量，從而評(píng)估細(xì)胞增殖情況。熒光強(qiáng)度與細(xì)胞內(nèi)EdU摻入的多少成正比，因此反映了細(xì)胞增殖的活躍程度。

二、優(yōu)勢(shì)

1）高靈敏度：能夠檢測到少量處于增殖狀態(tài)的細(xì)胞，對(duì)于研究細(xì)胞早期增殖或低增殖率的細(xì)胞群體具有優(yōu)勢(shì)。

2）簡單快捷：實(shí)驗(yàn)操作相對(duì)簡便，染色過程耗時(shí)較短，與傳統(tǒng)方法（如Brdu摻入法）相比，不需要復(fù)雜的DNA變性等步驟。

3）兼容性好：可以與其他細(xì)胞標(biāo)記技術(shù)或染色方法聯(lián)合使用，例如可同時(shí)進(jìn)行免疫熒光染色，以進(jìn)一步了解增殖細(xì)胞的特定表型或蛋白表達(dá)情況。

4）對(duì)細(xì)胞損傷?。河捎贓dU染料分子較小，在細(xì)胞內(nèi)更容易擴(kuò)散，且無需嚴(yán)苛的樣品變性處理，可有效避免對(duì)細(xì)胞造成損傷，有助于在組織、器官的整體水平上更真實(shí)地觀測細(xì)胞增殖情況。

三、步驟

1、細(xì)胞培養(yǎng)與處理（貼壁細(xì)胞為例）

將細(xì)胞接種在合適的培養(yǎng)板或培養(yǎng)皿中，一般取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞，重懸至2×105個(gè)/mL，將100μL細(xì)胞懸液加入每孔（96孔板），放置37ºC恒溫培養(yǎng)箱中孵育過夜；根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求進(jìn)行相應(yīng)的處理和刺激，使其正常生長至所需密度。

2、EdU摻入

將EdU稀釋至20µM，每孔加入100µL EdU工作液，使?jié)舛葹?0µM，繼續(xù)37℃孵育2h，確保EdU充分摻入到新合成的DNA中。棄培養(yǎng)基，用PBS洗滌1~2次。

3、細(xì)胞固定與通透

1）固定：每孔加入50μL 4%多聚甲醛固定細(xì)胞30min，以保持細(xì)胞的形態(tài)和結(jié)構(gòu)。

2）通透：對(duì)于某些細(xì)胞類型或?qū)嶒?yàn)要求，可能需要進(jìn)行通透處理，以增加細(xì)胞膜的通透性，使后續(xù)的染色試劑能夠更好地進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。常用的通透劑為含0.5% Triton X-100的PBS，孵育時(shí)間一般為10-20min。但如果實(shí)驗(yàn)僅需檢測細(xì)胞表面的EdU標(biāo)記，可不進(jìn)行通透處理。

4、染色反應(yīng)

每孔加入50µL反應(yīng)液，在室溫避光孵育30min，以使熒光染料與EdU充分結(jié)合。

細(xì)胞核染色（可選）：為了更好地觀察細(xì)胞形態(tài)和定位，可使用DAPI等細(xì)胞核染料對(duì)細(xì)胞核進(jìn)行染色。避光孵育5-10min。

5、圖像采集與計(jì)數(shù)：使用熒光顯微鏡或共聚焦顯微鏡采集圖像，并進(jìn)行細(xì)胞增殖的定量分析。通過計(jì)數(shù)EdU陽性細(xì)胞的數(shù)量或測量熒光強(qiáng)度等指標(biāo)，來評(píng)估細(xì)胞的增殖情況。

四、注意事項(xiàng)

1）不同細(xì)胞類型對(duì)EdU的攝取和摻入效率可能不同，因此需要通過預(yù)實(shí)驗(yàn)確定合適的EdU濃度和孵育時(shí)間，以保證檢測的準(zhǔn)確性和靈敏度，同時(shí)避免因EdU濃度過高或孵育時(shí)間過長對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒性影響。

2）在染色和核染色步驟中需要避免光照，以免影響染色效果。

3）在鋪板時(shí)確保細(xì)胞分布均勻，避免細(xì)胞過密或過稀，否則會(huì)使信號(hào)不均勻或局部過強(qiáng)。

如圖為不同處理下MDA-MB-468和MDA-MB-436細(xì)胞的增殖能力。

參考資料：

Dong F, Ruan S, Wang J, Xia Y, Le K, Xiao X, Hu T, Wang Q. M2 macrophage-induced lncRNA PCAT6 facilitates tumorigenesis and angiogenesis of triple-negative breast cancer through modulation of VEGFR2. Cell Death Dis. 2020 Sep 9;11(9):728. doi: 10.1038/s41419-020-02926-8. Erratum in: Cell Death Dis. 2022 Aug 30;13(8):752. doi: 10.1038/s41419-022-05203-y. PMID: 32908134; PMCID: PMC7481779.

Zhang Q, Yang L, Liu YH, Wilkinson JE, Krainer AR. Antisense oligonucleotide therapy for H3.3K27M diffuse midline glioma. Sci Transl Med. 2023 Apr 12;15(691):eadd8280. doi: 10.1126/scitranslmed.add8280. Epub 2023 Apr 12. PMID: 37043556; PMCID: PMC10263181.

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