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在進(jìn)行清潔驗(yàn)證時(shí)，我們通常需要確定一系列限度，這些限度包括對(duì)活性蛋白或其他主要物質(zhì)成分的分析、清潔劑的分析、生物負(fù)載水平的分析、內(nèi)毒素水平的分析，以及對(duì)設(shè)備進(jìn)行目視檢查以確保其清潔。如果存在任何與活性蛋白或其他工藝組分相關(guān)的特殊毒性物質(zhì)，如細(xì)胞毒性、變應(yīng)原性或生殖危害物，生產(chǎn)商的毒理學(xué)或生理學(xué)團(tuán)隊(duì)必須評(píng)估是否需要調(diào)整這些限度，或者是否需要使用專用設(shè)備以確保安全。

在討論這些限度時(shí)，我們應(yīng)考慮自然殘留物以及生產(chǎn)過(guò)程的不同階段，比如原液生產(chǎn)與配制/分裝階段。原液生產(chǎn)階段包括所有旨在獲取活性藥物的步驟，而配制/分裝階段則涉及將原液加入到成品制劑中，并進(jìn)行藥品物質(zhì)的初級(jí)包裝。原液生產(chǎn)過(guò)程可以進(jìn)一步細(xì)分為上游生產(chǎn)步驟，即在藥物收獲前的所有步驟，以及下游生產(chǎn)步驟，包括藥物的純化和后續(xù)步驟。這些階段的考慮對(duì)于確保清潔驗(yàn)證的限度既科學(xué)又實(shí)用至關(guān)重要。

1，活性物限度的關(guān)鍵問(wèn)題

在生物技術(shù)領(lǐng)域，清潔過(guò)程可能會(huì)導(dǎo)致活性分子，尤其是蛋白質(zhì)，發(fā)生結(jié)構(gòu)改變和降解。以下是蛋白質(zhì)降解的主要機(jī)制：

①在堿性溶液中，尤其是在高溫條件下，含有氫氧化鈉或氫氧化鉀的溶液會(huì)使蛋白質(zhì)水解成可溶的寡聚物或自由氨基酸。

② 酯基團(tuán)的水解，例如皂化反應(yīng)，將脂肪和油脂轉(zhuǎn)化為甘油和脂肪酸。

③ 次氯酸鈉作為一種清潔劑，能有效去除變性蛋白質(zhì)殘留。它是一種強(qiáng)氧化劑，能使蛋白質(zhì)降解成更小的片段。使用時(shí)需注意其對(duì)不銹鋼的潛在危害，并確保漂洗循環(huán)能徹底清除氯離子殘留。

④ 在高pH值環(huán)境下，蛋白質(zhì)水解受時(shí)間和溫度的顯著影響，pH值和溫度越高，水解越容易發(fā)生。

蛋白質(zhì)降解后的小片段更易溶于水，更容易通過(guò)清潔和漂洗過(guò)程從設(shè)備表面去除。此外，高pH值環(huán)境下的蛋白質(zhì)水解可能導(dǎo)致其生物活性不可逆地顯著下降。

在實(shí)驗(yàn)室中，可以通過(guò)將活性物質(zhì)暴露在模擬清潔條件下的清潔溶液中，然后對(duì)生成的混合物進(jìn)行分析和生物化學(xué)測(cè)試來(lái)驗(yàn)證活性物的降解。

由于活性物質(zhì)的降解，生物技術(shù)制造商在清潔驗(yàn)證流程中通常不直接設(shè)置活性限度或檢測(cè)活性。清潔過(guò)程完成后，理論上不應(yīng)有活性物質(zhì)殘留。因此，通常使用總有機(jī)碳（TOC）等非特異性分析方法來(lái)檢測(cè)蛋白質(zhì)殘留或片段。需要注意的是，清潔后的真正蛋白質(zhì)殘留非常低，因?yàn)門OC檢測(cè)的是所有有機(jī)碳源，而不僅僅是活性蛋白的殘余。

在制劑和最終分裝中，蛋白質(zhì)活性限度的設(shè)定通常基于污染量計(jì)算（MAC或最大可允許的傳遞量），與小分子清潔驗(yàn)證使用同樣的方法。如果清潔方法導(dǎo)致活性蛋白降解為小分子片段，該方法代表了最差情況。對(duì)于長(zhǎng)期使用的產(chǎn)品，一個(gè)典型的方法是允許隨后制造的最大活性日治療劑量的產(chǎn)品中攜帶不超過(guò)最小活性日治療劑量的1/1000。此外，如果計(jì)算允許在隨后的藥物產(chǎn)品中活性蛋白殘留量超過(guò)10ppm，可以使用10 ppm活性藥物蛋白的限度。單位面積的限度可以基于下一個(gè)最小批量的藥物生產(chǎn)所共用的設(shè)備面積上計(jì)算出來(lái)。

在原液生產(chǎn)中，制劑/分裝的污染量計(jì)算通常不適用，因?yàn)槿绻廴玖坑?jì)算基于整個(gè)生產(chǎn)線的設(shè)備表面積，限度會(huì)非常低，除非藥物活性成分在清潔過(guò)程中不會(huì)降解，否則無(wú)法用現(xiàn)行分析技術(shù)測(cè)量?；钚晕锏臍埩敉ǔＭㄟ^(guò)TOC等間接測(cè)量方法來(lái)檢測(cè)。通常清潔驗(yàn)證TOC的定量限度大約為100-500 ppb碳，與含碳量為50%的約200-1000 ppb蛋白質(zhì)的數(shù)值等效。

另一種建立活性物限度的方法是基于毒理學(xué)計(jì)算，這涉及到活性物質(zhì)短期的毒理學(xué)數(shù)據(jù)，最終得出允許的日攝入量（ADI）。如果數(shù)據(jù)是基于口服的毒理學(xué)，對(duì)注射藥的清潔應(yīng)增加安全系數(shù)。這種基于安全考慮的計(jì)算通常會(huì)導(dǎo)致較高的限度。如果活性蛋白降解，相關(guān)的毒理學(xué)數(shù)據(jù)更可能是降解碎片的毒理學(xué)，而不是天然蛋白質(zhì)的毒理學(xué)，通常認(rèn)為后者安全問(wèn)題更少。

2，清潔劑的限度

在生物制藥生產(chǎn)中，清潔劑的限度取決于不同的生產(chǎn)階段，如制劑/分裝和原液生產(chǎn)。一個(gè)典型的清潔程序可能包括使用強(qiáng)堿性清潔劑，隨后是磷酸鹽清潔劑，或者先是堿性清潔劑后是酸性清潔劑，這些步驟都是分開(kāi)進(jìn)行的。

① 市售化學(xué)試劑的限度：如果清潔過(guò)程中僅使用了市售化學(xué)試劑，如氫氧化鈉和磷酸，通常會(huì)基于電導(dǎo)率值來(lái)設(shè)定間接的限度。更精確的方法是，基于毒理學(xué)污染量計(jì)算或工藝參數(shù)效果來(lái)確定氫氧化鈉或磷酸的可接受水平，并將電導(dǎo)率限度設(shè)定在特定溫度下的相應(yīng)濃度。這個(gè)限度通常比相同溫度下的注射用水的電導(dǎo)率限度要嚴(yán)格，例如設(shè)定為5 μS/cm。這是因?yàn)檫@個(gè)限度比科學(xué)計(jì)算的限定值更嚴(yán)格。此外，由于磷離子或鈉離子可能是后續(xù)產(chǎn)品的成分，少量的污染并不明顯。需要注意的是，市售化學(xué)試劑的毒性計(jì)算是基于極端情況，因?yàn)檫@些化學(xué)物質(zhì)不會(huì)以其原始形式污染最終產(chǎn)品。如果這些化學(xué)物質(zhì)高濃度污染，工藝檢查（如pH的顯著變化）會(huì)發(fā)現(xiàn)這種不符合性。因此，目標(biāo)是確認(rèn)清潔劑含量非常低，而不是要求與注射用水的標(biāo)準(zhǔn)一致。允許電導(dǎo)率限度略高于注射用水的原因是，一旦水從循環(huán)管路中取出并通過(guò)清潔設(shè)備，就不應(yīng)期望它一定滿足WFI的電導(dǎo)率限度。

②處方清潔劑的限度：對(duì)于制劑/分裝制造，處方清潔劑（可能包含無(wú)機(jī)氫氧化物和多種有機(jī)組分）殘留量的限度通?；谄涠唐诙拘裕↙D50）數(shù)據(jù)來(lái)計(jì)算污染量。這種毒性資料可以由清潔劑制造商提供，或基于處方成分分析的最壞情況假設(shè)來(lái)計(jì)算。如果處方清潔劑的默認(rèn)值比污染量計(jì)算的值更嚴(yán)格，也可以采用。處方清潔劑的默認(rèn)值一般為10ppm。活性物污染量計(jì)算與處方清潔劑污染量計(jì)算的不同之處在于，它們對(duì)后續(xù)產(chǎn)品的污染限度計(jì)算方法不同，一個(gè)使用的是劑量比率，而另一個(gè)用的是半致死率LD50比率。一旦完成計(jì)算，隨后的清潔劑限度計(jì)算使用與活性物同樣的公式，來(lái)確定每個(gè)拭子或每個(gè)分析樣品的限度。

對(duì)于原液生產(chǎn)，適用于活性物限度的一些問(wèn)題也同樣適用于清潔劑。也就是說(shuō)，考慮到整個(gè)共享面積的污染量計(jì)算值通常非常低，難以測(cè)量。但是，使用的處方洗滌劑通常在分離提純過(guò)程中可以根據(jù)分子量去除（例如通過(guò)超濾或分子排阻色譜法）。與活性成分的限度一樣，毒性計(jì)算可能適用于下游純化后的步驟或下游工藝的最后一個(gè)容器。

3，微生物限度

在考慮清潔后微生物限度時(shí)，重要的是要認(rèn)識(shí)到清潔過(guò)程本身并不會(huì)使設(shè)備達(dá)到無(wú)菌狀態(tài)。即便設(shè)備將在位滅菌或在下一產(chǎn)品生產(chǎn)前進(jìn)行滅菌，通常的做法是評(píng)估微生物負(fù)載，以確保后續(xù)的生產(chǎn)工藝不會(huì)受到過(guò)度的微生物挑戰(zhàn)。一般來(lái)說(shuō)，達(dá)到非無(wú)菌生產(chǎn)環(huán)境下的微生物限度標(biāo)準(zhǔn)（即每平方厘米表面取樣1-2CFU）就已經(jīng)足夠。

對(duì)于沖洗取樣，不同公司可能會(huì)采用不同的微生物限度標(biāo)準(zhǔn)。一些公司可能會(huì)采用典型的注射用水標(biāo)準(zhǔn)（WFI值，即每100毫升水中10 CFU），而其他公司可能會(huì)采用每100毫升水中100 CFU或1,000 CFU的標(biāo)準(zhǔn)。設(shè)定較高限度的原因是設(shè)備隨后將進(jìn)行滅菌處理，因此允許有更高的微生物限度。

此外，需要注意的是，WFI值是在管路中循環(huán)的注射用水的標(biāo)準(zhǔn)。一旦這些水從循環(huán)管路中取出并加入到設(shè)備中，就不應(yīng)期望其微生物限度必然符合原有的注射用水標(biāo)準(zhǔn)。這是因?yàn)樵谵D(zhuǎn)移過(guò)程中，水可能會(huì)從空氣中吸收微生物，導(dǎo)致微生物含量增加。因此，在設(shè)定微生物限度時(shí)，需要考慮到這些因素，以確保生產(chǎn)環(huán)境的安全性和產(chǎn)品的質(zhì)量問(wèn)題。

4，內(nèi)毒素限度

內(nèi)毒素的污染問(wèn)題在產(chǎn)品最終階段尤為關(guān)鍵，因此對(duì)最終產(chǎn)品的內(nèi)毒素污染量需要特別關(guān)注。在這一過(guò)程中，內(nèi)毒素的測(cè)定通常在最終的沖洗水中進(jìn)行，其限度一般設(shè)定為符合注射用水的標(biāo)準(zhǔn)，即0.25EU/ml。

在細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中，內(nèi)毒素去除步驟之前的沖洗水取樣應(yīng)達(dá)到注射用水的限度。然而，對(duì)于使用大腸桿菌這類革蘭氏陰性細(xì)菌進(jìn)行的細(xì)菌發(fā)酵過(guò)程，由于這些細(xì)菌在沖洗過(guò)程中可能產(chǎn)生大量?jī)?nèi)毒素，因此在發(fā)酵和收獲步驟之后的清洗中達(dá)到注射用水限度是不現(xiàn)實(shí)的。在這種情況下，一些公司會(huì)設(shè)定一個(gè)更高的內(nèi)毒素限度，如5至25 EU/mL。

達(dá)到這一更高的限度水平表明清潔工藝是受控的，而且任何在這一水平上的潛在污染都應(yīng)在隨后的內(nèi)毒素清除步驟中進(jìn)行評(píng)估。這樣的做法確保了即使在難以完全清除內(nèi)毒素的發(fā)酵過(guò)程中，最終產(chǎn)品的質(zhì)量也能得到保障。

5，視覺(jué)清潔標(biāo)準(zhǔn)

外觀目測(cè)是驗(yàn)證殘留物去除效果的一種直接方法。雖然它不是一種定量手段，但對(duì)于檢查產(chǎn)品表面的清潔狀況非常有用。只要能夠接觸到關(guān)鍵表面，外觀目測(cè)就很容易執(zhí)行，它可以確認(rèn)生產(chǎn)設(shè)備重要區(qū)域的清潔程度。根據(jù)文獻(xiàn)，少量的殘留物如果存在，通常是可見(jiàn)并可被察覺(jué)的。在生物制藥領(lǐng)域，目測(cè)清潔標(biāo)準(zhǔn)通常作為清潔驗(yàn)證方案的一部分，用于測(cè)試擦拭和/或沖洗液中的殘留物。這種方法有助于確保生產(chǎn)設(shè)備在關(guān)鍵區(qū)域的清潔度達(dá)到預(yù)期標(biāo)準(zhǔn)。

6，修改限度

作為日常工藝驗(yàn)證監(jiān)測(cè)的一部分，應(yīng)設(shè)立行動(dòng)限度和警戒限度。這些限度通常比驗(yàn)證方案中設(shè)定的合格/失敗限度更為嚴(yán)格。通過(guò)觀察工藝能力的連續(xù)低水平表現(xiàn)以及維持這些水平的能力，可以進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估?；谶@樣的評(píng)估，可以考慮在未來(lái)的驗(yàn)證方案中采用更嚴(yán)格的限度標(biāo)準(zhǔn)。這種做法有助于確保工藝的持續(xù)穩(wěn)定性和產(chǎn)品質(zhì)量的高標(biāo)準(zhǔn)。