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（一）Trizol法

 

一、 實(shí)驗(yàn)原理

 

Trizol是一種酸性試劑，能從細(xì)胞和組織中快速分離RNA，其主要成分為異硫氰酸胍（GITC）和苯酚。裂解細(xì)胞后，GITC能使蛋白質(zhì)和RNase變性，有利于保護(hù)RNA的完整性；加入氯仿離心后，樣品分為水相和有機(jī)相，RNA存在于上層水相中，而DNA和蛋白質(zhì)則存在于中間層及下層有機(jī)相中，從而達(dá)到分離的目的。簡(jiǎn)單來(lái)講就是裂解細(xì)胞使RNA得以釋放，加之有機(jī)溶劑使RNA與DNA、蛋白質(zhì)分離，并進(jìn)一步純化得到RNA的過(guò)程。

 

二、 主要的試劑、儀器與耗材

 

Trizol試劑、氯仿、異丙醇、75%乙醇、RNase free Water、低溫冷凍離心機(jī)、勻漿器或組織研磨器、渦旋振蕩器、金屬浴、微量移液器、通風(fēng)櫥、計(jì)時(shí)器、1.5ml EP管等。

 

三、 提取步驟

 

1.樣品的制備

 

1)細(xì)胞：按1ml Trizol試劑/5-10×10^6細(xì)胞的比例加入Trizol試劑（注：一般來(lái)講待細(xì)胞在六孔板上生長(zhǎng)至80%左右時(shí)，每孔收集的細(xì)胞加1ml Trizol即可）；

 

2)組織：按1ml Trizol試劑/50-100mg組織的比例加入Trizol試劑并在冰上勻漿處理，以利于RNA的釋放（注：組織可以先用液氮急凍后研磨處理，也可用勻漿器或者組織研磨器進(jìn)行處理，但要注意保持低溫，以防RNA降解）；

 

室溫裂解5-10min。

 

2.氯仿抽提

 

每1ml Trizol中加入200ul的氯仿，蓋好EP管蓋后用手劇烈顛倒混勻15s左右，室溫孵育2-3min。2-8℃，12000g離心15min后溶液分為三層，從上到下依次為水相（RNA）、中間層及有機(jī)相（DNA、蛋白質(zhì)等），轉(zhuǎn)移水相至新的EP管中（注：此步一定要小心謹(jǐn)慎，慢慢吸取，不可觸及中間層，以免RNA被污染）。

 

3.異丙醇沉淀

 

每1ml Trizol中加入500ul異丙醇，上下顛倒混勻后，室溫孵育10min，2-8℃，12000g離心10min，得到的白色沉淀即為RNA沉淀（注：異丙醇最好提前預(yù)冷，維持低溫環(huán)境，以防RNA被降解）。

 

4.乙醇洗滌

 

棄去上清，加入1ml 75%乙醇（每1ml Trizol）洗滌RNA沉淀，2-8℃，7500g離心5min（注：75%乙醇可以用無(wú)水乙醇及無(wú)酶水來(lái)配制，同樣最好預(yù)冷處理；清洗時(shí)動(dòng)作要輕柔，過(guò)于劇烈會(huì)導(dǎo)致RNA沉淀散開(kāi)，再次離心未免會(huì)重聚，從而造成RNA的損失）。

 

5.溶解

 

棄去上清，于通風(fēng)櫥內(nèi)干燥RNA沉淀5-10min，用50ul左右的無(wú)酶水重懸沉淀，即可得到RNA溶液（注：干燥時(shí)間不可過(guò)長(zhǎng)，太過(guò)干燥會(huì)導(dǎo)致沉淀很難溶解，部分溶解的RNA的260/280的比值會(huì)大大降低，甚至低于1.6；亦可采用金屬浴60℃，5min以助溶）。

 

6.RNA質(zhì)量的檢測(cè)

 

1)微量分光光度計(jì)

 

純RNA的260/280比值在2.0左右，若比值偏小，則代表可能有蛋白或有機(jī)溶劑的污染，比值偏大則代表RNA可能發(fā)生降解。

 

2)瓊脂糖凝膠電泳

 

可見(jiàn)三條帶，從上往下一般為28s RNA、18s RNA及5s RNA，一般情況下5s的帶非常淡，甚至看不清，28s帶的亮度應(yīng)為18s帶亮度的2倍，且不存在拖尾，即可證明RNA純度可以，如若5s很明顯，而28s 與18s帶的亮度并無(wú)太大差別，甚至出現(xiàn)涂抹狀的條帶則高度提示RNA降解。

 

（二）柱式法

 

一、 實(shí)驗(yàn)原理

 

離心柱法主要是利用離心柱中的硅膠基質(zhì)吸附RNA，再通過(guò)洗滌去除雜質(zhì)從而得到RNA的一種常用方法。相較于Trizol法，離心柱法因操作簡(jiǎn)便、耗時(shí)短、純度高等優(yōu)點(diǎn)而得到廣泛應(yīng)用，但也因其吸附柱規(guī)格的限制在大批量操作時(shí)具有一定的局限性，此外，針對(duì)特殊的樣本，其提取的效果也大不如Trizol法好。

 

二、 主要的試劑、儀器與耗材

RNA提取試劑盒、氯仿、無(wú)水乙醇、RNase free Water、低溫冷凍離心機(jī)、勻漿器或組織研磨器、微量移液器、通風(fēng)櫥、計(jì)時(shí)器、1.5ml EP管、2ml EP管等。

 

三、 提取步驟

1.樣品處理：

細(xì)胞：貼壁細(xì)胞每106細(xì)胞加入1ml裂解液，吹打混勻。

 

懸浮細(xì)胞：植物、動(dòng)物、酵母每10^6細(xì)胞加入1ml裂解液。

 

細(xì)菌細(xì)胞每107細(xì)胞加入1ml裂解液混勻。

 

組織：新鮮或-70℃凍存100mg組織加1ml裂解液，勻漿處理。

 

2.室溫放置5min，使核酸蛋白復(fù)合物完全分離；

 

3.向勻漿樣品中加入0.2ml的氯仿，蓋好管蓋，劇烈振蕩15s，室溫放置3-5min；

 

4.2-8℃，12000rpm離心10min。RNA主要存在于上層水相中把水相轉(zhuǎn)移至新的EP管中（注：不可吸到沉淀）；

 

5.吸附柱前處理：在吸附柱中加入500ul洗柱液，室溫放置2min，2-8℃，12000rpm離心2min，棄廢液（小Tips：此步可以在第四步離心還剩2min左右的時(shí)候進(jìn)行，這樣第四步離心結(jié)束就可以直接進(jìn)行洗柱，而不需要再等時(shí)間）；

 

6.在收集的上清中加入200ul無(wú)水乙醇混勻，加入吸附柱中靜置2min，2-8℃，12000rpm離心2min，棄廢液；

 

7.向吸附柱中加入600ul漂洗液（注：新買(mǎi)的試劑盒中漂洗液還需要加入一定量的無(wú)水乙醇，此步一定要確認(rèn)漂洗液是否加入無(wú)水乙醇），2-8℃，12000rpm離心2min，棄廢液；

 

8.向吸附柱中加入600ul漂洗液，2-8℃，12000rpm離心2min，棄廢液（注：漂洗液在7-8步共加了兩次哦）；

 

9.12000rpm離心2min，棄掉收集管，將吸附柱置于室溫?cái)?shù)分鐘（10-15min）以去除殘留的漂洗液（注：最好在通風(fēng)櫥進(jìn)行，以免RNA酶對(duì)RNA的降解；通風(fēng)櫥在使用前也可先紫外30min）；

 

10.將吸附柱放入新管中，向膜中央滴加50-100ul RNase free ddH2O（通常取中間值），室溫放置5min，12000rpm室溫離心2min即可得到RNA溶液（注：所有步驟中僅最后一步離心是在室溫，其余均在2-8℃，因此，前幾步離心拿出樣品后一定要及時(shí)關(guān)上離心機(jī)蓋子，以免升溫，而在第9步離心結(jié)束后就可以打開(kāi)離心機(jī)蓋子使其快速升至室溫）。

 

四、 注意事項(xiàng)

1．佩戴手套、口罩，消毒操作臺(tái)，杜絕外源酶的污染；

2．所用試劑耗材必須無(wú)酶化，有條件者可以直接購(gòu)買(mǎi)，否則就要做好高壓滅菌的工作；

3．得到RNA溶液后可保存于-80℃，避免反復(fù)凍融，放置時(shí)間不可過(guò)長(zhǎng)；

4．對(duì)于組織RNA的提取，一定要充分勻漿處理以使RNA充分釋放出來(lái)。