中文字幕一级黄色A级片|免费特级毛片。性欧美日本|偷拍亚洲欧美1级片|成人黄色中文小说网|A级片视频在线观看|老司机网址在线观看|免费一级无码激情黄所|欧美三级片区精品网站999|日韩av超碰日本青青草成人|一区二区亚洲AV婷婷

前言

 

有關(guān)物質(zhì)方法較含量測定而言是一個更加復(fù)雜和瑣碎的體系，含量測定僅要求準(zhǔn)確分析主成分，有關(guān)物質(zhì)方法需要研究所有可能的雜質(zhì)，同時對未知雜質(zhì)也要進(jìn)行適當(dāng)分離。

 

然而，研究過程復(fù)雜多變，每個雜質(zhì)有它的脾氣，在開發(fā)過程中，又會有很多未知因素左右，在基于自然科學(xué)的基礎(chǔ)上，需要及時識別異常事件對方法的影響，避免掉入坑里，久久不能自拔。

 

下面筆者根據(jù)多年的實踐經(jīng)驗來分析方法開發(fā)過程中的細(xì)節(jié)。

 

1、儀器狀態(tài)

 

目前主流的高效液相色譜儀有Waters、Agilent、Shimadzu、Thermofisher，這些品牌之間在設(shè)計、布局、耐壓等有所區(qū)別，各有特點，同時有常規(guī)液相和超高效液相(Ultra Performance Liquid Chromatography，UPLC)。

 

Waters

 

Shimadzu

 

Agilent

 

Thermofisher

 

對于新儀器而言，出廠經(jīng)過嚴(yán)格的質(zhì)檢，同時安裝后會進(jìn)行“3Q”驗證，確保儀器的各項指標(biāo)均是正常的，一般來說進(jìn)行方法開發(fā)、驗證以及轉(zhuǎn)移問題不大。然而，對于二手儀器而言，是需要多留一個心眼。當(dāng)下經(jīng)濟(jì)下行，投融資環(huán)境惡劣，生物醫(yī)藥正在經(jīng)歷一場寒冬，很多公司在儀器采購時，傾向于二手儀器。由于二手儀器魚龍混雜，有的設(shè)備用了5年，有的10年，甚者還有20年。那么在方法轉(zhuǎn)移時，如果你是采用的二手儀器開發(fā)的方法，接收方為全新的儀器，那么這時需要評估風(fēng)險，尤其有關(guān)物質(zhì)方法比較復(fù)雜，主峰與相鄰雜質(zhì)距離非常近。筆者曾經(jīng)遇到過這種情況，二手儀器之前維修過，部分管路由不銹鋼換成peek管，沒有按原有長度替換，導(dǎo)致與轉(zhuǎn)入方儀器的死體積不一致，最后通過測量長度，把過長的部分截掉，重新調(diào)整梯度優(yōu)化方法，完成方法轉(zhuǎn)移。

 

2、儀器死體積

 

1、死體積指的是有效進(jìn)樣點到有效檢測點之間排除色譜柱中包含固定相部分的體積。包括 4 部分：

 

進(jìn)樣器至色譜柱管路體積

 

柱內(nèi)固定相顆粒間隙（被流動相占據(jù)，Vm）

 

柱出口管路體積

 

檢測器流通池體積。

 

其中只有 Vm 參與色譜平衡過程，其他3部分只起峰擴(kuò)展作用。為防止峰擴(kuò)展，這3部分體積應(yīng)盡量減小。

 

2、系統(tǒng)死體積一般通過進(jìn)樣基本不保留的小分子來測定。尿嘧啶、丙酮和硫脲是反相色譜中最常用的測試物質(zhì)；死時間與死體積相關(guān)；可以用死體積除以流速測定。

 

3、管路若需要更換，盡量采用相同內(nèi)徑及長度的管路進(jìn)行替換，確保方法的重現(xiàn)性。

 

4、另外接裝色譜柱時，需確保管線接頭匹配完好（特別注意peek管接頭的使用，以及管線與色譜柱的連接處）避免形成接頭空腔（如下圖）

 

 

5、若產(chǎn)生接頭空腔，會增大系統(tǒng)死體積，同時會導(dǎo)致色譜峰展寬，影響峰形及分離度。

 

3、色譜柱載碳量

 

同樣是C18色譜柱，不同品牌的色譜柱千差萬別，其中載碳量是一個很重要的參數(shù)，一般C18色譜柱的載碳量參數(shù)是在10%~20%之間，載碳量越高，保留及分離能力越強(qiáng)，因此，在做方法學(xué)驗證耐用性-不同品牌色譜柱時，需要關(guān)注載碳量是否有明顯的區(qū)別。

 

4、鬼峰

 

輔料在制劑中使用非常廣泛，然而很多輔料是惰性的，在溶劑中無法溶解，因此樣品前處理時可能需要離心或過濾，對于溶解性能強(qiáng)的溶劑，需要注意在樣品前處理時，濾膜、過濾器或離心管是否有未知物被溶解，導(dǎo)致產(chǎn)生未知色譜峰；筆者曾經(jīng)做過一個片劑的項目，制劑中總是會固定出現(xiàn)一個未知雜質(zhì)峰，忽大忽小。經(jīng)過調(diào)查發(fā)現(xiàn)是注射器的原因，將塑料注射器更換為玻璃注射器后，未知雜質(zhì)峰（鬼峰）完全消失，不再出現(xiàn)。

 

5、緩沖鹽

 

方法開發(fā)中有時會用到緩沖鹽，如磷酸鹽、醋酸鹽等，有時參考的方法來源中，使用純鹽相和有機(jī)相進(jìn)行梯度洗脫，剛開始色譜峰形及分離度良好，后來慢慢地發(fā)現(xiàn)保留時間、分離度等發(fā)生變化，且會出現(xiàn)明顯的梯度峰，干擾檢測；出現(xiàn)這種現(xiàn)象主要是因為日常使用維護(hù)不到位所致。

一般來說，純鹽的流動相最好不要超過2天，用不完配制新鮮的緩沖鹽，尤其在夏季，微生物滋生較快，且在儀器運(yùn)行過程中，seal wash一定要開啟，否則泵頭積累的鹽會損壞泵頭密封圈；色譜柱在使用后需要充分沖洗；純鹽管路用熱水進(jìn)行沖洗維護(hù)；若使用了長菌的流動相，色譜柱的柱效會急劇下降，很難再生恢復(fù)。

 

6、純化水

 

純化水在反相體系下使用較為頻繁，水的質(zhì)量非常關(guān)鍵，尤其是方法采用梯度洗脫且采集波長靠近末端，影響尤為明顯。一般在方法轉(zhuǎn)移時，可能會出現(xiàn)問題，若短時間內(nèi)無法有效解決，可以嘗試指定某個品牌的純凈水。

 

7、對照品

 

方法開發(fā)時，為了節(jié)約對照品，一般會先用原料藥進(jìn)行開發(fā)，做方法預(yù)驗證，采用對照品進(jìn)行確認(rèn)，大多數(shù)情況下沒有問題；但是對于一個多晶型的化合物而言，是需要關(guān)注的，因為對照品的合成路線及結(jié)晶工藝有可能和你的原料藥不一致，導(dǎo)致在溶解對照品時產(chǎn)生差異，甚至無法溶解，這種情況需要重新采購別的品牌對照品或自己標(biāo)定對照品。