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凡應(yīng)用校準(zhǔn)曲線的分析方法，都是在樣品測得信號值后，從校準(zhǔn)曲線上查得其含量或濃度。所以，繪制準(zhǔn)確的校準(zhǔn)曲線，直接影響到樣品分析結(jié)果的準(zhǔn)確與否。而斜率表示了校準(zhǔn)曲線的靈敏度，更是重要的檢驗(yàn)參數(shù)。

 

一、校準(zhǔn)曲線及參數(shù)的定義

 

1. 校準(zhǔn)曲線的定義

 

校準(zhǔn)曲線：是指描述待測物質(zhì)濃度或量與相應(yīng)的測量儀器響應(yīng)量或其它指示量之間的定量關(guān)系的曲線。校準(zhǔn)曲線包括標(biāo)準(zhǔn)曲線和工作曲線。

 

標(biāo)準(zhǔn)曲線：取不同含量標(biāo)準(zhǔn)溶液，直接加入試劑，顯色后進(jìn)行測定，得出濃度值與信號值的線性關(guān)系。

 

工作曲線：取不同量標(biāo)準(zhǔn)溶液，經(jīng)過與樣品分析相同的前處理步驟(如蒸餾、消解、水浴、萃取、振蕩等)，由此得出濃度值與信號值之間的線性關(guān)系。

 

注意：如經(jīng)過試驗(yàn)證實(shí)，標(biāo)準(zhǔn)溶液系列在省略部分操作步驟時，直接測量的響應(yīng)值與全部操作步驟具有一致結(jié)果時，可允許省略步驟。

 

2. 校準(zhǔn)曲線相關(guān)參數(shù)的定義

 

空白試驗(yàn)：在制作校準(zhǔn)曲線時必須同時作兩個空白試驗(yàn)?？瞻自囼?yàn)是除用水代替樣品外，其他所加試劑和操作步驟均與樣品測定完全相同的操作過程。

 

試驗(yàn)用水、試劑質(zhì)量、器皿、實(shí)驗(yàn)室環(huán)境及操作過程中的沾污等因素都影響空白試驗(yàn)的測定值(即空白值)。如空白值出現(xiàn)異常，會影響測定結(jié)果的準(zhǔn)確度，應(yīng)從上述幾方面尋找原因。

 

這些影響因素控制好后，每個分析項(xiàng)目的空白值均會在一定范圍內(nèi)波動。一般來說，空白值越小越好。

 

相關(guān)系數(shù)(r)：表示校準(zhǔn)曲線的精密度，分光光度法要求r≥0.999，否則應(yīng)查找原因加以糾正，重新制作合格的校準(zhǔn)曲線。

 

截距(a)：表示校準(zhǔn)曲線的準(zhǔn)確度。影響因素包括容量器具，光度測量儀器的誤差(比色皿的成套性，非單色光引起的偏差，儀器的線性等)、操作誤差等，也有方法本身的因素。校準(zhǔn)曲線截距的最后一位數(shù)，應(yīng)與因變量的最后一位數(shù)取齊。

 

斜率(b)：表示校準(zhǔn)曲線的靈敏度。它除了受方法的靈敏度影響外，還與顯色反應(yīng)條件(如環(huán)境溫度、顯色溫度、試驗(yàn)用水、試劑質(zhì)量、顯色溶液的pH值)、標(biāo)準(zhǔn)溶液的準(zhǔn)確度、測量儀器的靈敏度、波長的準(zhǔn)確度以及分析人員的操作水平等有較大關(guān)系。

 

上述這些影響因素控制好，大多數(shù)分析項(xiàng)目的斜率能保持在一定的范圍內(nèi)，當(dāng)發(fā)現(xiàn)斜率上移或下降，超出了范圍，應(yīng)從各影響因素中查找。

 

線性范圍：是某分析方法校準(zhǔn)曲線的直線部分所對應(yīng)的待測物質(zhì)濃度或量的變化范圍。

 

二、如何檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)曲線？

 

1. 校準(zhǔn)曲線的線性檢驗(yàn)

 

校準(zhǔn)曲線的線性檢驗(yàn)，即精密度檢驗(yàn)。根據(jù)數(shù)理統(tǒng)計(jì)知識，若2個變量呈線性關(guān)系，則關(guān)系的密切程度可用簡單線性相關(guān)系數(shù)r來表示。在Excel中的函數(shù)是PEARSON（皮爾生）函數(shù)。r值的范圍在-1~1。r>0為正相關(guān)，r<0為負(fù)相關(guān)。r的絕對值越大，則相關(guān)程度越高；r值越接近于0，相關(guān)越不密切；當(dāng)r=0時，表示2個變量之間不相關(guān)。

 

在水質(zhì)檢驗(yàn)中，明確要求|r| ≥0.999；對于石墨爐原子吸收光譜法，|r| ≥0.995也能接受。

 

某些分析項(xiàng)目，由于含量很低或操作中的影響因素較多，如原子吸收中的石墨爐分析，某些氣相色譜項(xiàng)目，相關(guān)系數(shù)可適當(dāng)放寬，要求|r|≥0.995。

 

如果校準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)不能滿足規(guī)定的要求，則應(yīng)找出原因并加以糾正，重新繪制合格的校準(zhǔn)曲線。通常情況下，影響校準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)的因素主要包括：標(biāo)樣系列的配制、測定波長、光源狀態(tài)、進(jìn)樣方式及分析方法本身的精密度、儀器的精密度等。

 

2. 校準(zhǔn)曲線的截距檢驗(yàn)

 

校準(zhǔn)曲線的截距檢驗(yàn)，即準(zhǔn)確度檢驗(yàn)。截距表示試劑空白的大小，它是圍繞總體均值0呈正態(tài)分布的隨機(jī)變量，是實(shí)驗(yàn)室誤差在y軸上的反映。實(shí)驗(yàn)誤差越小，截距越趨近于0。理想的回歸直線，截距a=0。

 

一般要求a≤0.005，當(dāng)a>0.005時，應(yīng)作截距的顯著性檢驗(yàn)。但由于存在難以控制的隨機(jī)因素，實(shí)驗(yàn)中存在正的或負(fù)的系統(tǒng)誤差，多數(shù)回歸直線的截距不為0。遇到這種情況時，需要按統(tǒng)計(jì)程序?qū)⑺媒鼐郺與0作t檢驗(yàn)，即顯著性檢驗(yàn)。

 

經(jīng)檢驗(yàn)，在給定置信水平下（通常取95%）無顯著性差異時，a方可作0處理；若a與0存在顯著性差異，表示校準(zhǔn)曲線的回歸計(jì)算結(jié)果準(zhǔn)確度不高，應(yīng)找出原因予以校正?；貧w方程如果不經(jīng)上述檢驗(yàn)和處理就直接投入使用，則必將給測定結(jié)果引入差值等于a的系統(tǒng)誤差。

 

截距檢驗(yàn)也可以采用截距a對相對剩余標(biāo)準(zhǔn)偏差SE的相對值作為檢驗(yàn)指標(biāo)。根據(jù)經(jīng)驗(yàn)值，其容許范圍為≥30%。對于不同的分析方法和精密度要求，容許范圍可作適當(dāng)?shù)恼{(diào)整。

 

3. 斜率檢驗(yàn)

 

即檢驗(yàn)分析方法的靈敏度，方法靈敏度是隨實(shí)驗(yàn)條件的變化而改變的，在完全相同的分析條件下，僅由于操作中的隨機(jī)誤差導(dǎo)致的斜率變化不應(yīng)超出一定的允許范圍，此范圍因分析方法的精度不同而異。

 

例如：一般來說，分子吸收分光光度法要求其相對差值小于5%，而原子吸收分光光度法則要求其相對差值小于10%等。

 

4. 剩余標(biāo)準(zhǔn)偏差或相對偏差的檢驗(yàn)

 

由于校準(zhǔn)曲線的斜率常隨環(huán)境溫度、試劑批號和貯存時間等實(shí)驗(yàn)條件的改變而變動，因此，在測定試樣的同時繪制校準(zhǔn)曲線是最為理想的。

 

但在實(shí)際檢測工作中，當(dāng)一定期限內(nèi)的環(huán)境、氣候、儀器、人員等條件變化不大時，可以使用相同的校準(zhǔn)曲線，而不需要每次都繪制。

 

此時，需要根據(jù)設(shè)備或方法的穩(wěn)定性定期對校準(zhǔn)曲線進(jìn)行檢查，使用的統(tǒng)計(jì)量就是剩余標(biāo)準(zhǔn)偏差SE或相對偏差。

 

剩余標(biāo)準(zhǔn)偏差SE是通過線性回歸法，計(jì)算縱坐標(biāo)預(yù)測值所產(chǎn)生的標(biāo)準(zhǔn)誤差。在Excel中的函數(shù)是STEYX函數(shù)。校準(zhǔn)曲線用y=a+bx來表示。

 

根據(jù)正態(tài)分布原理，線性方程在不同置信水平下的置信區(qū)間為式(1)~式(3)：

 

68.3%置信區(qū)間y=a+bx±SE   (1)

 

95.5%置信區(qū)間y=a+bx±2SE  (2)

 

99.7%置信區(qū)間y=a+bx±3SE  (3)

 

當(dāng)檢查校準(zhǔn)曲線時，需要測定空白平行樣和曲線中間點(diǎn)濃度平行樣，并分別求取信號值的平均值，再以中間點(diǎn)濃度的信號值扣除空白。當(dāng)所獲信號值沒有落在相應(yīng)置信區(qū)間時，則曲線不能再被使用，需要重新測定標(biāo)樣系列，并重新制作回歸曲線。

 

三、斜率運(yùn)用及穩(wěn)定性判斷

 

對于校準(zhǔn)曲線斜率穩(wěn)定的分析項(xiàng)目，誤差較小，在樣品分析中可以使用原校準(zhǔn)曲線，但應(yīng)在樣品分析同時，帶兩個空白試驗(yàn)和一個中間標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)。中間標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)測定值與標(biāo)準(zhǔn)曲線相應(yīng)點(diǎn)濃度的相對誤差不超過10%，否則應(yīng)重新制作校準(zhǔn)曲線。盡管如此，校準(zhǔn)曲線也應(yīng)兩個月制作一次。

 

在比色分析中，當(dāng)儀器條件發(fā)生變化(如調(diào)換光源燈泡，儀器波長校正，或儀器經(jīng)過維修等因素)、標(biāo)準(zhǔn)溶液新配制時，標(biāo)準(zhǔn)曲線也應(yīng)重新制作。

 

以環(huán)境監(jiān)測項(xiàng)目為例，如分析中空白試驗(yàn)的吸光度出現(xiàn)了異常，校準(zhǔn)曲線的斜率達(dá)不到要求，都要逐一尋找原因，直到符合要求為止。

 

下表歸納整理了部分環(huán)境監(jiān)測分析項(xiàng)目的空白試驗(yàn)吸光度和標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率的范圍，相關(guān)分析人員可以進(jìn)行參考，如表1。

 

校準(zhǔn)曲線的影響因素錯綜復(fù)雜，例如實(shí)驗(yàn)用水不僅能引起空白值的偏高，也可能引起截距和斜率的變化。而且每個分析項(xiàng)目的影響因素又不完全相同，因此要求每個分析人員能熟練運(yùn)用，具體問題具體分析。