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一、實(shí)驗(yàn)原理

MTT實(shí)驗(yàn)的原理依賴于細(xì)胞內(nèi)琥珀酸脫氫酶的活性。這種酶能催化MTT分子在細(xì)胞內(nèi)的還原過(guò)程，形成水不溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶甲瓚（Formazan），并沉積在細(xì)胞中?；罴?xì)胞具有此酶的功能，因此能夠產(chǎn)生甲瓚結(jié)晶，而死細(xì)胞缺乏這種功能。二甲基亞砜（DMSO）被用來(lái)溶解細(xì)胞內(nèi)的甲瓚結(jié)晶。通過(guò)酶標(biāo)儀在490nm或570nm波長(zhǎng)處測(cè)定甲瓚溶解后的光吸收值。

在一定細(xì)胞數(shù)量范圍內(nèi)，MTT結(jié)晶形成的量與細(xì)胞數(shù)成正比。因此，透過(guò)測(cè)定的光密度值（即OD值），我們能夠推斷出活躍細(xì)胞的數(shù)目。高OD值代表著細(xì)胞的活性較高，而低OD值可能意味著細(xì)胞數(shù)量較為稀少或者細(xì)胞的活性較為低下。在藥物毒性評(píng)估方面，高OD值則意味著藥物的毒性較小。

主要用途：

1、評(píng)估細(xì)胞活性和增殖能力：MTT實(shí)驗(yàn)可用于評(píng)估細(xì)胞的活性和增殖能力。通過(guò)測(cè)量MTT還原產(chǎn)生的紫色產(chǎn)物的形成量，可以間接反映細(xì)胞的代謝活性和增殖狀態(tài)。

2、藥物篩選和藥物毒性評(píng)價(jià)：MTT實(shí)驗(yàn)廣泛用于藥物篩選和藥物毒性評(píng)價(jià)?？衫肕TT實(shí)驗(yàn)來(lái)測(cè)試候選藥物的抗癌活性、抗炎活性等，并評(píng)估藥物對(duì)細(xì)胞的毒性和安全性。

二、實(shí)驗(yàn)步驟（以貼壁細(xì)胞為例）

1、重懸細(xì)胞：將貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞經(jīng)胰酶消化處理，以獲得單個(gè)細(xì)胞的懸浮液。使用含有10%胎牛血清的培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞懸浮液的濃度，以確保細(xì)胞在接種后能夠良好地生長(zhǎng)和繁殖。

2、接種細(xì)胞：將每毫升細(xì)胞懸浮液中含有103至104個(gè)細(xì)胞的數(shù)量接種到96孔板中。每個(gè)孔加入200微升的細(xì)胞懸浮液，確保每個(gè)孔內(nèi)細(xì)胞的均勻分布。

3、添加受試藥物培養(yǎng)細(xì)胞：將96孔板置于37攝氏度、5%二氧化碳的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，使細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)。隨后，加入不同濃度的藥物，培養(yǎng)時(shí)間根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要確定，一般為2至3天。

4、呈色：向每個(gè)孔中加入20微升的MTT溶液，使MTT的最終濃度為0.5毫克/毫升，繼續(xù)培養(yǎng)3至4小時(shí)。這將導(dǎo)致MTT濃度從5.0毫克/毫升降至0.5毫克/毫升，并使細(xì)胞內(nèi)的活細(xì)胞能夠?qū)TT還原為紫色的甲瓚形成，吸取96孔板每個(gè)孔的培養(yǎng)液，每孔加入150微升DMSO，低速振蕩10min溶解結(jié)晶。

5、比色：使用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀測(cè)量每個(gè)孔的吸光度值。測(cè)量時(shí)，波長(zhǎng)為490nm或570nm。

6、結(jié)果計(jì)算：

計(jì)算細(xì)胞增值率：測(cè)得各組的OD值后，求每組的平均值，再用以下公式計(jì)算各組的細(xì)胞增殖率：細(xì)胞增殖率（%）＝加藥組OD值/對(duì)照組OD值×100%

如對(duì)于100ug/ml的藥物，其增殖率=0.080/0.614=0.130。

三、注意事項(xiàng)

1、設(shè)置空白對(duì)照組：為了確保準(zhǔn)確性，需要將空白對(duì)照孔（含有培養(yǎng)基、MTT和二甲基亞砜的孔）設(shè)置為零吸光度。這樣可以消除由培養(yǎng)基和試劑本身引起的背景吸光，使測(cè)量結(jié)果更為準(zhǔn)確。

2、確定細(xì)胞接種濃度：細(xì)胞接種時(shí)的濃度選擇對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果具有至關(guān)重要的影響。如果濃度過(guò)低，可能導(dǎo)致信號(hào)過(guò)于微弱，而濃度過(guò)高則可能因?yàn)榧?xì)胞之間的相互干擾而干擾結(jié)果的準(zhǔn)確性。應(yīng)根據(jù)細(xì)胞的生長(zhǎng)速度和特性，選擇適當(dāng)?shù)慕臃N濃度。

3、MTT試劑的保存應(yīng)避光，而在加入MTT試劑時(shí)，如果采用排槍或速度較快的操作，則不必過(guò)于擔(dān)心光照的影響。然而，若需要進(jìn)行長(zhǎng)時(shí)間的操作，則務(wù)必確保在避光條件下進(jìn)行，以免光照對(duì)試劑產(chǎn)生影響。

如圖所示為MTT實(shí)驗(yàn)測(cè)不同處理組的細(xì)胞活性