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什么是瓊脂糖凝膠電泳?

 

瓊脂糖凝膠電泳是一種電泳形式，用于根據(jù)核酸（DNA或RNA）片段的大小進(jìn)行分離。當(dāng)施加電流時(shí)，帶負(fù)電的DNA/RNA通過瓊脂糖凝膠的孔隙向凝膠帶正電的一端遷移，較小的片段遷移較快。由此產(chǎn)生的條帶可以用紫外線（UV）光來觀察。

 

瓊脂糖凝膠電泳的工作原理是怎樣的?

 

瓊脂糖是瓊脂的一種成分，它形成了一個(gè)由螺旋狀的瓊脂糖分子組成的三維凝膠基質(zhì)，這些螺旋狀的瓊脂糖分子在超線圈束中被氫鍵固定，有通道和孔隙，分子能夠通過。當(dāng)加熱時(shí)，這些氫鍵斷裂，使瓊脂糖變成液體，并允許它在復(fù)位前被倒入模具。

 

 

 

 

瓊脂糖在凝膠中的百分比影響了孔的大小，從而影響了可能通過的分子的大小以及通過的速度。瓊脂糖的百分比越高，孔徑越小，因此能夠通過的分子越小，遷移速度越慢。

 

在分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室中，0.7~1%的瓊脂糖凝膠通常用于日常的DNA分離，對0.2~10kb范圍內(nèi)的片段提供良好、清晰的區(qū)分。較大的片段可以用較低百分比的凝膠來解決，但它們會(huì)變得非常脆弱且難以處理，而較高百分比的凝膠會(huì)對小片段提供更好的分辨率，但很脆且可能凝固不均勻。

 

由于DNA在肉眼中是不可見的，在凝固過程中，一種夾層染料如溴化乙錠(EtBr)被納入凝膠中。這與DNA結(jié)合，并在紫外線下發(fā)出熒光，從而使DNA片段可以被觀察到。存在的DNA越多，條帶就越亮。

 

與加載染料混合的樣本被放置在凝膠的一端，凝膠被浸泡在運(yùn)行緩沖液中。然后電流通過凝膠槽兩端的電極穿過凝膠。

 

 

 

 

瓊脂糖凝膠放置在緩沖液槽中，樣品與加載染料混合后放置在凝膠一端的孔中，施加電流使帶負(fù)電的DNA向正電極(陰極)移動(dòng)

 

當(dāng)樣品運(yùn)行得足夠遠(yuǎn)以獲得足夠的分離時(shí)，將凝膠從槽中取出并放在一個(gè)紫外光箱上。然后，夾層染料可以使樣品條帶可視化，并通過與已知條帶大小的DNA marker進(jìn)行比較來確定其大小。遷移距離和片段大小之間的關(guān)系是非線性的，增加了包括尺寸標(biāo)記作為指導(dǎo)的重要性(圖3)。

 

 

 

 

A)圖片左側(cè)描述了DNA電泳的典型結(jié)果。在左邊，有一個(gè)尺寸標(biāo)記，用來作為樣品DNA片段長度(以堿基對為單位)的參考。標(biāo)記的右邊是三個(gè)樣品。圖片顯示了較小的DNA片段如何在瓊脂糖凝膠中比較大的DNA片段移動(dòng)得更遠(yuǎn)。

 

B) 圖片右側(cè)的圖表顯示了DNA片段的大小與遷移距離之間的非線性關(guān)系。這是一條負(fù)的曲線，當(dāng)DNA片段變大時(shí)，它們在凝膠中遷移的距離就會(huì)減少。

 

DNA凝膠電泳的步驟

 

在選擇、設(shè)置、運(yùn)行和分析瓊脂糖凝膠的過程中，有一些關(guān)鍵步驟，我們現(xiàn)在將介紹這些步驟。

 

確定所需的凝膠百分比

 

0.7-1%的瓊脂糖凝膠通常對大多數(shù)應(yīng)用來說是足夠的，但重要的是選擇一個(gè)適合你的樣品和預(yù)期片段大小的百分比。將瓊脂糖粉末與用于運(yùn)行凝膠的相同類型的緩沖液結(jié)合起來，加熱使混合物融化，避免沸騰。

 

下表為不同瓊脂糖凝膠濃度所對應(yīng)的線性DNA最佳分辨范圍：

 

 

 

 

三乙酰-乙二胺四乙酸(EDTA)(TAE)或三硼酸-EDTA(TBE)[5]通常是首選的緩沖液，因?yàn)槿崛芤菏俏A性條件下的有效緩沖液，可保持DNA去質(zhì)子化并溶于水。EDTA是一種螯合劑，能使可能損害被分析的DNA的核酸酶失活。

 

凝膠澆注

 

選擇所需尺寸的凝膠澆注模具和梳子，為所有樣品和marker提供足夠數(shù)量的孔，以及容納每個(gè)待裝樣品數(shù)量的孔容量。用鑄造框架或膠帶固定模具的兩端，以便在凝膠凝固時(shí)將其固定。

 

在模具的底部加入DNA夾層染料，如果使用的是EtBr，通常濃度為0.2-0.5 µg/ml。EtBr是一種誘變劑的證據(jù)目前仍有爭議，但因此，許多實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)轉(zhuǎn)而使用替代品[6]，如GelRed。

 

加入凝膠，注意不要過度填充模具，并確保夾層染料均勻混合。凝膠太熱時(shí)不要倒入，否則模具可能會(huì)變形或破裂。

 

將樣品/marker與加載染料混合

 

加載染料具有多種功能，它們可以讓用戶看到他們原本無色的樣品在哪里，使其更容易將樣品準(zhǔn)確地移入孔中，從而減少孔間樣品交叉污染的可能性。

 

當(dāng)凝膠運(yùn)行時(shí)，染料與樣品一起遷移，使用戶能夠知道樣品在凝膠中的位置，并防止樣品跑得太遠(yuǎn)而流失到緩沖液中。沒有加載染料的DNA樣品在加載時(shí)也會(huì)傾向于分散到運(yùn)行緩沖液中，因?yàn)樗鼈兊拿芏容^小。

 

因此，大多數(shù)加載染料含有甘油或Ficoll，這使得樣品-染料混合物更密，所以它沉淀在孔的底部。溴酚藍(lán)是一種流行的著色劑選擇，但有些也含有額外的染料，如二甲苯氰醇。雖然可以購買加載染料，但許多實(shí)驗(yàn)室選擇自己制作。

 

如果你的樣品量非常小(例如，少于5 µL)，在這個(gè)階段加入一點(diǎn)水可能是有利的，這樣更容易有效和均勻地裝載到凝膠孔。

 

同樣，如果你預(yù)計(jì)某些樣品中的DNA濃度比其他樣品高得多，那么在這個(gè)階段也可能有必要向這些濃縮樣品的樣品-染料混合物中加水。

 

如果你不這樣做，在可視化過程中，這些條帶給出的強(qiáng)信號可能會(huì)掩蓋較弱的條帶，或者需要對強(qiáng)條帶進(jìn)行過度曝光以觀察較弱的條帶，在凝膠圖像上形成明亮、扭曲的區(qū)域。

 

凝膠裝入

 

從設(shè)定好的凝膠上取下澆注框/膠帶，并將其放入凝膠槽中，確保孔位于負(fù)電極(一般為黑色)，將運(yùn)行緩沖液(TAE或TBE)注入槽中，使凝膠被淹沒。

 

小心地取下梳子，輕輕地將樣品-染料(如果使用水)混合液移入孔中。盡量避免用移液器吸頭接觸孔的邊緣，因?yàn)樗鼈兛赡軙?huì)破裂，使一個(gè)樣品跑到下一個(gè)孔中。過量的孔會(huì)產(chǎn)生同樣的結(jié)果。DNA的樣本量過大也會(huì)在運(yùn)行過程中減慢DNA的遷移。

 

裝上標(biāo)記marker，最好是在樣品行的兩端各裝一個(gè)。凝膠不一定總是在一條完美的直線上運(yùn)行，所以在兩端各裝一個(gè)marker可以更容易確定存在的片段的大小。有多種marker可供選擇，并且標(biāo)明了不同的尺寸，選擇一個(gè)最適合你期望的尺寸。

 

凝膠運(yùn)行

 

將蓋子放在電極黑對黑、紅對紅的罐子上，并將電極插入一個(gè)電源盒，也是黑對黑、紅對紅，這與凝膠罐一起構(gòu)成了凝膠電泳儀。

 

確保電極和蓋子的方向正確，否則你的樣品會(huì)從孔中倒流到運(yùn)行緩沖液中。設(shè)定凝膠運(yùn)行的時(shí)間和電壓，120V、35分鐘是一個(gè)很好的近似值，但是這應(yīng)該根據(jù)所使用的凝膠比例和預(yù)期分離的片段大小進(jìn)行調(diào)整，以獲得良好的電分離。

 

在瓊脂糖凝膠上施加電流會(huì)使其發(fā)熱，電壓越高，發(fā)熱越多，所以當(dāng)運(yùn)行低百分比的凝膠時(shí)，最好使用較低的電壓以防止熔化。

 

增加電壓以使凝膠運(yùn)行得更快是很誘人的，然而，這可能會(huì)導(dǎo)致【笑臉凝膠】，即帶子在兩端向上彎曲，使其難以確定正確的帶子大小。這是指凝膠開始輕微融化，使條帶運(yùn)行不均勻。這也會(huì)導(dǎo)致條帶出現(xiàn)涂抹狀和不清晰的情況。

 

可視化

 

一旦樣品在凝膠上運(yùn)行了大部分(染料前部會(huì)使其可見)，關(guān)閉電源。

 

戴上手套，輕輕地將模具中的凝膠從槽中取出，排掉多余的運(yùn)行緩沖液，并將其轉(zhuǎn)移到一個(gè)適當(dāng)?shù)娜萜髦械淖贤庀渲?，以便進(jìn)行可視化。更換手套以防止凝膠或運(yùn)行緩沖液中的夾層染料污染周圍的表面、門把手等。

 

如果下游應(yīng)用需要DNA片段，可以用手術(shù)刀小心地從凝膠中切除相應(yīng)的條帶，同時(shí)將其放在黑暗房間的紫外光箱上。確保你戴上紫外線面罩，并在燈箱開啟時(shí)保持皮膚覆蓋，以防止紫外線對皮膚或眼睛的傷害。

 

凝膠電泳結(jié)果的判讀

 

瓊脂糖凝膠可以在暗室中的紫外光箱上進(jìn)行觀察，或者使用與相機(jī)相連的獨(dú)立燈箱。

 

無論使用哪種系統(tǒng)，紫外光從下面照射凝膠，DNA條帶由于與它們結(jié)合的夾層染料而發(fā)出熒光，可以用帶有專門的紫外線過濾器的照相機(jī)來記錄。

 

標(biāo)記物marker有一份說明書，表明它們包括的每個(gè)條帶的大小。通過將其與樣品通道中的條帶進(jìn)行比較，可以確定條帶的大小。樣品之間DNA的相對數(shù)量也可以進(jìn)行比較，因?yàn)檩^高的DNA濃度會(huì)產(chǎn)生較亮的條帶。圖中顯示了一個(gè)例子。

 

 

 

瓊脂糖凝膠電泳的技巧

 

膠液的制備

 

稱取0.4g瓊脂糖，置于200ml錐形瓶中，加入50ml0.5×TBE 稀釋緩沖液，放入微波爐里加熱，直到瓊脂糖全部熔化，取出搖勻，此為0.8%瓊脂糖凝膠液?？傄后w量不宜超過錐瓶的50%容量。否則會(huì)溢出來的。加熱過程中要不時(shí)搖動(dòng)，使附于瓶壁上的瓊脂糖顆粒進(jìn)入溶液。加熱時(shí)應(yīng)蓋上封口膜，以減少水分蒸發(fā)。

 

膠板的制備

 

倒膠時(shí)的溫度不可太低，否則凝固不均勻;

 

速度也不可太快，否則容易出現(xiàn)氣泡;

 

待膠完全凝固后撥出梳子，注意不要損傷梳底部的凝膠。

 

加樣

 

注意上樣時(shí)小心操作，避免損壞凝膠或?qū)悠凡鄣撞磕z刺穿。

 

電泳

 

加完樣后，合上電泳槽蓋，立即接通電源?？刂齐妷罕３衷?0-80V，電流在40mA以上。當(dāng)溴酚藍(lán)條帶移動(dòng)到距凝膠前沿約2cm時(shí)，停止電泳。

 

染色

 

未加EB的膠板在電泳完畢后移入0.5μg/ml 的EB 溶液中，室溫下染色20-25 分鐘。

 

觀察和拍照

 

在波長為254nm 的長波長紫外燈下觀察染色后的或已加有EB 的電泳膠板。DNA 存在處顯示出肉眼可辨的桔紅色熒光條帶。紫光燈下觀察時(shí)應(yīng)戴上防護(hù)眼鏡或有機(jī)玻璃面罩，以免損傷眼睛。

 

瓊脂糖凝膠電泳問題點(diǎn)及分析

 

加樣孔有熒光

 

下圖的紅框部分就是一個(gè)典型的加樣孔有熒光的例子。發(fā)生這種現(xiàn)象可能的原因如下：

 

 

 

首先一定有DNA 的滯留，其次多含蛋白質(zhì)殘留;如果是比較特殊的樣品，其雜質(zhì)也可能導(dǎo)致熒光。蛋白質(zhì)幾乎不會(huì)被EB 染色，能出現(xiàn)熒光，則一定含有核酸。非常巨大的基因組DNA (>50kb)，如果使用普通的瓊脂糖電泳，往往不能電泳出孔，單獨(dú)就可能滯留在加樣孔中產(chǎn)生熒光。

 

更多的時(shí)候，是比較大的DNA 與殘留的蛋白質(zhì)結(jié)合后，電泳不能出孔而在孔中產(chǎn)生熒光。酶反應(yīng)產(chǎn)物，如果沒有經(jīng)過純化去除酶，也非常容易在孔中出現(xiàn)熒光，其原因是酶與核酸幾乎都有比較強(qiáng)的結(jié)合能力(基因組DNA 的PCR 產(chǎn)物電泳往往在孔中都有熒光，而且熒光強(qiáng)度與體系的特異性成反比。)。如果是植物樣品，還可能由其它雜質(zhì)殘留引起。

 

那么，這么多種可能性，到底是什么東西殘留呢?

 

按照經(jīng)驗(yàn)是：蛋白質(zhì)殘留的熒光有點(diǎn)發(fā)悶，其它雜質(zhì)殘留亮得很刺眼，且薄得銳利。如上面那個(gè)例子，這么亮，這么銳利，肯定不會(huì)是蛋白質(zhì)啦。

 

總RNA 非變性電泳顯示28S 不如18S 亮

 

如下圖所示，18S 明顯地比28S 亮了。

 

 

 

如果28S 和18S 的條帶清晰無彌散，那么多提示28S 沒有被EB 飽和。RNA 殘留多時(shí)，基因組DNA 的電泳也會(huì)有相似現(xiàn)象。

 

解決方法：簡單的補(bǔ)染就可以解決此問題。再次電泳時(shí)，或者降低上樣量，或者直接增加膠中EB 的量。保證28S 比18S 亮堂很多很多。

 

降解

 

降解的現(xiàn)象，情況是比較多的總結(jié)如下：主帶不再突出，向小片段方向發(fā)生彌散，亮度比較均衡地衰減。

 

如果同時(shí)還伴隨下列的一個(gè)或者多個(gè)現(xiàn)象，則需要更進(jìn)一步的檢測：加樣孔非常的亮、彌散發(fā)生在主條帶位置的上下兩個(gè)方向、從加樣孔即開始發(fā)生彌散。

 

如下圖所示，紅框里面的就是典型的降解的現(xiàn)象。

 

 

 

其實(shí)，以現(xiàn)在的裂解液的裂解能力而言，降解的發(fā)生主要是在徹底勻漿之前，只有極少量由不干凈的溶解液導(dǎo)致。

 

以總RNA 抽提為例，總RNA 的質(zhì)量由高到低依次為懸浮細(xì)胞、貼壁細(xì)胞、組織。徹底裂解懸浮細(xì)胞的時(shí)間最短，徹底裂解組織的時(shí)間最長，這就是降解多發(fā)生在徹底勻漿之前的一個(gè)佐證。再看一看新鮮樣品和冷凍保存樣品，非常嚴(yán)格的冷凍保存和勻漿操作的確可以確保冷凍樣品的核酸的質(zhì)量;但是，有許多實(shí)驗(yàn)室并不具備嚴(yán)格的保存手段，實(shí)驗(yàn)人員的操作也并非完美，其結(jié)果就是核酸的降解。

 

事實(shí)上，RNA 抽提受的影響因素太多，就以基因組DNA 的抽提為例看一看吧。

 

假定消化使用的是含蛋白酶K的溶液，無論你使用的是新鮮樣品還是冷凍保存樣品，如果混勻徹底，可以預(yù)期的降解為：細(xì)胞：不應(yīng)該降解，碾碎的組織：不應(yīng)該降解，大塊組織：部分降解。

 

如果電泳發(fā)現(xiàn)新鮮的細(xì)胞和碾碎的新鮮組織發(fā)生了降解現(xiàn)象，該現(xiàn)象是假象;如果電泳發(fā)現(xiàn)冷凍的細(xì)胞和碾碎的冷凍組織發(fā)生了降解現(xiàn)象，該現(xiàn)象不是假象，就是樣品在保存中已經(jīng)降解了。說得更極端一點(diǎn)，即使蛋白酶K失活了，消化試劑的裂解能力也足以保證細(xì)胞的基因組DNA 在抽提過程中間不被降解。

 

那么，如何才能減少或者杜絕核酸降解呢?

 

那就是：一定要將重點(diǎn)放在樣品被徹底勻漿之前，其次就是要縮短樣品從脫離原來的生存環(huán)境或者低溫到被徹底勻漿之間的時(shí)間，越快越好。