中文字幕一级黄色A级片|免费特级毛片。性欧美日本|偷拍亚洲欧美1级片|成人黄色中文小说网|A级片视频在线观看|老司机网址在线观看|免费一级无码激情黄所|欧美三级片区精品网站999|日韩av超碰日本青青草成人|一区二区亚洲AV婷婷

內(nèi)毒素是導(dǎo)致污染藥品、制劑成分和醫(yī)療器械引起的發(fā)熱反應(yīng)的主要原因。重組生物制藥產(chǎn)品是使用生物體制造的，包括革蘭氏陰性細(xì)菌。革蘭氏陰性細(xì)菌死亡時(shí)，其外細(xì)胞膜中的內(nèi)毒素（也稱為脂多糖）會(huì)釋放到裂解液中，它們可以與生物分子相互作用并形成鍵，包括目標(biāo)治療化合物。生物制品的內(nèi)毒素污染也可能通過水、原料（如輔料）、培養(yǎng)基、添加劑、血清、設(shè)備、容器封閉系統(tǒng)以及生產(chǎn)中使用的表達(dá)系統(tǒng)發(fā)生。因此，生產(chǎn)過程迫切需要通過監(jiān)測(cè)關(guān)鍵步驟的原料和中間體，以及最終藥品產(chǎn)品釋放測(cè)試，來減少和去除內(nèi)毒素的方法。這篇綜述論文重點(diǎn)討論了三個(gè)主要主題：內(nèi)毒素檢測(cè)技術(shù)、生產(chǎn)治療分子的上游工藝，以及在產(chǎn)品純化過程中消除內(nèi)毒素的下游工藝。最后，我們從高純度和低成本的角度評(píng)估了內(nèi)毒素去除工藝的有效性。

 

內(nèi)毒素的"身份證"

 

內(nèi)毒素存在于革蘭氏陰性細(xì)菌的外細(xì)胞壁中，膜的完整性和穩(wěn)定性得到增強(qiáng)，且在細(xì)胞破裂時(shí)釋放其成分到外部環(huán)境。因此，使用革蘭氏陰性菌生產(chǎn)生物制品時(shí)，可能會(huì)帶來內(nèi)毒素的污染。此外，生物制品的內(nèi)毒素污染還可能通過水源、原料、設(shè)備、容器封閉系統(tǒng)以及生產(chǎn)過程中使用的表達(dá)系統(tǒng)等途徑發(fā)生。

結(jié)構(gòu)：內(nèi)毒素由三個(gè)部分構(gòu)成，長鏈多糖 (O-抗原)，核心多糖和脂質(zhì)A (圖 1a從上到下)。長鏈多糖是一種由重復(fù)寡糖亞基組成的菌株特異性表面抗原，核心多糖具有外部己糖區(qū)和內(nèi)部庚糖區(qū)，脂質(zhì)A是一種非極性脂質(zhì)結(jié)構(gòu)。

物理性質(zhì)：核心多糖和O-抗原都是親水的，而脂質(zhì)A是疏水的。內(nèi)毒素非常穩(wěn)定，不易被加熱條件和pH破壞。內(nèi)毒素還可能與目標(biāo)蛋白形成穩(wěn)定的相互作用，這會(huì)使分離變得復(fù)雜。

毒性和劑量：內(nèi)毒素的毒性與脂質(zhì)A相關(guān)，脂質(zhì)A會(huì)觸發(fā)促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生和凝血級(jí)聯(lián)反應(yīng)的激活，從而導(dǎo)致敗血癥和敗血性休克。每小時(shí)每公斤體重僅1 ng的內(nèi)毒素就可引起熱原反應(yīng)。內(nèi)毒素測(cè)量的標(biāo)準(zhǔn)單位是內(nèi)毒素單位 (EU)，相當(dāng)于0.1 ng大腸桿菌內(nèi)毒素的活性。對(duì)于靜脈注射，每小時(shí)最多可以給患者每公斤體重注射5 EU的內(nèi)毒素，可接受的濃度取決于所需劑量。

圖 1. (a) 來自大腸桿菌內(nèi)毒素的化學(xué)結(jié)構(gòu)示意圖，內(nèi)毒素是由長鏈多糖 (O-抗原)，核心多糖和非極性脂質(zhì)A尾部構(gòu)成的脂多糖結(jié)構(gòu) (b) 內(nèi)毒素以膠束，立方體，層狀或囊泡形式聚集，在藥物溶液中呈現(xiàn)凈負(fù)電荷。帶負(fù)電荷的“膠束”內(nèi)毒素可以吸附在多聚陽離子配體上，或者可以通過疏水脂質(zhì)尾部與疏水表面的相互作用去除單個(gè)內(nèi)毒素單體

 

內(nèi)毒素的檢測(cè)方法

 

內(nèi)毒素的檢測(cè)技術(shù)多種多樣，但在此，我們將重點(diǎn)介紹一種目前被廣泛采用的檢測(cè)手段——鱟變形細(xì)胞裂解物檢測(cè)法，也就是我們常說的鱟試劑（LAL）。

 

與早期需要活體兔子進(jìn)行的兔熱原檢測(cè)（RPT）相比，LAL方法避免了使用動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，轉(zhuǎn)而利用鱟的血液提取物來進(jìn)行檢測(cè)。這種提取物主要通過以下三種形式被應(yīng)用：

 

凝膠法：此法將鱟血液提取物與待測(cè)樣品等量混合，若形成凝膠并穩(wěn)固于試管底部，即判定為陽性。陽性反應(yīng)需一定量的內(nèi)毒素觸發(fā)，檢測(cè)限在0.03-0.06EU/mL之間（見圖2a）。

顯色法：此法將凝膠法中的天然底物替換為可顯色底物，該底物在內(nèi)毒素激活的凝固酶作用下裂解，釋放顯色分子至溶液中，通過分光光度法測(cè)量，吸光度變化與內(nèi)毒素濃度成正比。

濁度法：與顯色法相似，濁度法通過測(cè)量溶液的濁度來評(píng)估鱟試劑與內(nèi)毒素反應(yīng)后的凝固效果，濁度變化率與內(nèi)毒素濃度成正比。

以上三種LAL方法都依賴于鱟血液中的同一種蛋白質(zhì)，即圖2c所示的C因子。內(nèi)毒素激活鱟試劑中的C因子后會(huì)發(fā)生凝血級(jí)聯(lián)反應(yīng)，隨之激活因子B，然后進(jìn)一步形成凝固酶。

顯色法和濁度法都可以通過終點(diǎn)法或動(dòng)力學(xué)法的形式測(cè)量。終點(diǎn)法：在樣品反應(yīng)終止時(shí)進(jìn)行一次性測(cè)量，根據(jù)最終的吸光度或濁度與內(nèi)毒素濃度的關(guān)聯(lián)來確定結(jié)果。動(dòng)力學(xué)法：與終點(diǎn)法相比，動(dòng)力學(xué)法通過在整個(gè)反應(yīng)過程中連續(xù)監(jiān)測(cè)吸光度或濁度的變化，來動(dòng)態(tài)評(píng)估內(nèi)毒素濃度的動(dòng)態(tài)關(guān)系。

 

圖 2. (a) 內(nèi)毒素誘導(dǎo)的鱟循環(huán)血淋巴防御機(jī)制。鱟變形細(xì)胞裂解物 (LAL) 檢測(cè)是根據(jù)鱟血液中產(chǎn)生的免疫原性反應(yīng)設(shè)計(jì)的。暴露于內(nèi)毒素后，電子致密的大顆粒 (L 顆粒) 和電子密度較低的小顆粒 (S 顆粒) 變形細(xì)胞會(huì)被酶原C因子激活; (b) 鱟血凝血級(jí)聯(lián)反應(yīng)。內(nèi)毒素激活質(zhì)膜結(jié)合C因子，C因子是一種單鏈糖蛋白 (分子量123 kDa)，由重鏈 (分子量80 kDa) 和輕鏈 (分子量43 kDa) 組成，在免疫系統(tǒng)中起著關(guān)鍵激活劑的作用。因子與內(nèi)毒素結(jié)合后，自催化活性觸發(fā) Phe-Ile 鍵的裂解，從而產(chǎn)生活化的C因子，該因子與B因子相互作用，將其轉(zhuǎn)化為凝固酶。凝固酶在肽C的兩個(gè)末端 (Arg-Lys和Arg-Gly) 處裂解凝固蛋白原，形成不溶性凝固蛋白凝膠；(c) 鱟血中活性凝固酶的蛋白水解活性特征可用于合成顯色劑，即 Gly-Arg-p-硝基苯胺底物 (而不是凝固素原) 通過分離對(duì)硝基苯胺 (pNA) 來檢測(cè)內(nèi)毒素。添加顯色底物后，活性蛋白酶凝固酶 Ac-Ile-Glu-Ala-Arg-pNA 會(huì)催化 pNA 的釋放，產(chǎn)生黃色，可通過測(cè)量405 nm處的吸光度 (或 340 nm 處的吸光度) 與標(biāo)準(zhǔn)曲線關(guān)聯(lián)獲得內(nèi)毒素濃度

 

上述所有LAL方法都被目前生物制藥機(jī)構(gòu)廣泛接受，并推出了諸多具有不同檢測(cè)精度的試劑盒 (表 1)。需要注意的是，LAL檢測(cè)方法仍然存在一些缺陷：

假陰性：內(nèi)毒素會(huì)被樣品中一些特殊緩沖液成分 (如檸檬酸和磷酸)，細(xì)胞培養(yǎng)基組分，表面活性劑 (如PS20和PS80) 或產(chǎn)品聚集掩蓋。干擾試劑會(huì)在內(nèi)毒素分子周圍形成一層掩蔽層，使其無法與LAL試劑發(fā)生反應(yīng)，這種現(xiàn)象通常伴隨著檢測(cè)中的低內(nèi)毒素回收率。理論上，待測(cè)樣品中能與內(nèi)毒素活性位點(diǎn)結(jié)合的游離金屬離子，肽，聚合物和蛋白質(zhì)都可能中和其生物活性，造成LAL檢測(cè)所依賴的級(jí)聯(lián)反應(yīng)被破壞。

假陽性：(1→3)-β-D-葡聚糖 (一種主要的細(xì)胞膜致熱原成分) 會(huì)觸發(fā)蛋白酶G因子通路，并形成與LAL反應(yīng)中相同的凝固蛋白終產(chǎn)物，因此待測(cè)樣品中含有該葡聚糖會(huì)造成假陽性。

 

表 1. 目前三種LAL檢測(cè)方法 (顯色法、凝膠法和濁度法) 的商品化試劑盒，以及基于rFC檢測(cè)法的商品化試劑盒

 

文中提到的其他內(nèi)毒素檢測(cè)方法在此只對(duì)基本原理做簡單介紹，感興趣建議下載文末原文閱讀：

兔熱原檢測(cè) (RPT)：這是一種傳統(tǒng)的內(nèi)毒素檢測(cè)方法，通過注射生物樣品至活兔體內(nèi)，觀察180分鐘內(nèi)體溫是否升高0.5℃來判斷。該方法因依賴活體、樣品消耗大且精度和靈敏度有限，使用已逐漸減少。

牛全血檢測(cè) (bWBA)：通過將牛全血與待測(cè)樣品混合，利用白細(xì)胞對(duì)內(nèi)毒素的反應(yīng)產(chǎn)生PGE2，其量與內(nèi)毒素濃度成正比。但此方法存在缺陷，如內(nèi)毒素的非特異性結(jié)合可能掩蓋單體，且牛全血不易收集。

重組C因子檢測(cè)：基于LAL原理，通過DNA克隆得到的重組C因子，不含G因子，避免了LAL中的非特異性糖結(jié)合導(dǎo)致的假陽性，檢測(cè)成本與LAL相當(dāng)。

單核細(xì)胞活化試驗(yàn) (MAT)：內(nèi)毒素激活單核細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子，通過一系列反應(yīng)，最終通過分光光度計(jì)測(cè)量吸光度來定量內(nèi)毒素，與LAL顯色法類似。

新興方法之電化學(xué)技術(shù)：多數(shù)基于電化學(xué)阻抗譜 (EIS)，通過電極與待測(cè)溶液接觸，測(cè)量內(nèi)毒素與電極-蛋白質(zhì)復(fù)合物接觸后電阻的變化來檢測(cè)。

新興方法之熒光和發(fā)光技術(shù)：利用生物發(fā)光法，將LAL測(cè)試中的終點(diǎn)物質(zhì)pNA作為熒光素酶的底物，通過生物發(fā)光反應(yīng)快速檢測(cè)內(nèi)毒素。

新興方法之表面等離子體共振和基于質(zhì)量的技術(shù)：等離子體生物傳感器使用光纖探頭技術(shù)，通過測(cè)量折射率變化監(jiān)測(cè)內(nèi)毒素結(jié)合。電磁壓電聲傳感器 (EMPAS) 則基于PMB功能化的石英表面，利用PMB對(duì)內(nèi)毒素的高親和力進(jìn)行檢測(cè)。

 

內(nèi)毒素的下游去除方法

 

在生物制品的整個(gè)制造過程中，下游工藝的內(nèi)毒素去除是控制內(nèi)毒素水平的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。內(nèi)毒素自身或與目標(biāo)蛋白形成的穩(wěn)定相互作用，對(duì)下游去除工藝構(gòu)成重大挑戰(zhàn)。本文主要探討了超濾、萃取、離子交換層析、親和層析和膜吸附等去除技術(shù)。

 

圖 3. 生物制藥生產(chǎn)，分離和純化步驟的簡要流程圖，主要分為上游發(fā)酵 (細(xì)胞培養(yǎng)) 和下游純化兩個(gè)部分

 

1. 超濾

 

單個(gè)內(nèi)毒素分子的分子量通常在10-30 kDa之間，它們的核心多糖和寡糖鏈能聚集形成高達(dá)1000 kDa分子量、直徑約0.1 µm的膠束和囊泡（見圖2b）。

 

超濾膜技術(shù)，具備固定孔徑，能有效從小分子目的蛋白溶液中分離出大分子膠束和囊泡。內(nèi)毒素從單體到膠束的形態(tài)轉(zhuǎn)換，對(duì)超濾去除效率有顯著影響。

 

蛋白濃度：例如，使用100 kDa截留量的超濾膜時(shí)，大于100 kDa的蛋白和內(nèi)毒素膠束會(huì)被截留，而小于100 kDa的內(nèi)毒素單體則能通過膜。研究表明，稀釋蛋白溶液可提高內(nèi)毒素的去除率，因?yàn)樵谳^低濃度下，一些大分子的內(nèi)毒素聚體可能解離成能透過膜的單體。

去垢劑濃度：例如，PS20能夠促使大分子內(nèi)毒素聚體解離為單體，同時(shí)削弱內(nèi)毒素與目的蛋白的結(jié)合，便于超濾膜的去除。隨著PS20濃度的增加，內(nèi)毒素的去除效率也隨之提高。

應(yīng)用范圍：超濾技術(shù)適用于從小分子量目的蛋白、水或鹽溶液中去除內(nèi)毒素。在這一過程中，超濾回流端會(huì)截留大分子內(nèi)毒素，而小分子目的蛋白則透過膜。需要注意的是，膜孔徑的選擇對(duì)收率有顯著影響，如使用10kDa膜的收率可達(dá)95%，而3kDa膜的收率可能降低約55%。

 

2. 萃取

 

溶劑萃取根據(jù)內(nèi)毒素在兩種不混溶液體中的相對(duì)溶解度差異將內(nèi)毒素與目標(biāo)治療藥物分離。內(nèi)毒素通常在有機(jī)相中形成分布，而親水性目標(biāo)分子則留在水相中。該方法對(duì)于高度污染樣品可以提供高內(nèi)毒素去除效率，但是目標(biāo)產(chǎn)品的收率損失可能會(huì)比較大。

案例一：1-辛醇作為有機(jī)相在去除T4、HAP1和F8噬菌體的內(nèi)毒素方面表現(xiàn)出64%至99.9%的高效率，但需注意其收率較低，僅為30-60%。此外，1-辛醇在水相中的殘留可能在LAL檢測(cè)中引起背景噪音。

 

案例二：利用去垢劑Triton X-114結(jié)合溫度變化可有效去除綠色熒光蛋白中的內(nèi)毒素。Triton X-114在0°C時(shí)與水完全混溶，而在23°C以上則發(fā)生相分離。在低溫時(shí)，Triton X-114、內(nèi)毒素和熒光蛋白共存于水相；溫度升高后，內(nèi)毒素隨Triton X-114轉(zhuǎn)入有機(jī)相，目標(biāo)蛋白則保留在水相中。

 

3. 陰離子交換層析

 

陰離子交換層析的配基帶正電，內(nèi)毒素的等電點(diǎn)約為2，在絕大多數(shù)層析條件下 (pH>2) 內(nèi)毒素都帶負(fù)電，而堿性目的蛋白則為正電荷。陰離子交換介質(zhì)在此條件下能夠有效地結(jié)合內(nèi)毒素，允許目的蛋白通過，實(shí)現(xiàn)兩者的有效分離。然而，對(duì)于帶有負(fù)電荷的酸性蛋白和質(zhì)粒DNA（pDNA），在確保產(chǎn)品收率的同時(shí)，陰離子交換層析在去除內(nèi)毒素上的效果可能會(huì)受限。

缺陷或限制：如果內(nèi)毒素和目的蛋白有強(qiáng)相互作用，其可能會(huì)隨目的蛋白一起流出層析柱，這時(shí)可以通過調(diào)高樣品pH來減弱內(nèi)毒素和目的蛋白之間的相互作用。如有案例在pH 7.9, 8.4, 8.9和9.2時(shí)檢測(cè)到的流穿液中內(nèi)毒素濃度分別為1400, 1800, 600和500 EU/mL，并且對(duì)目的蛋白的收率沒有顯著影響。

去除效果：一般陰離子層析可使?jié)饪s的溶液 (>1,000 EU/mL) 中內(nèi)毒素減少5個(gè)數(shù)量級(jí)，或使稀釋的溶液 (<100 EU/mL) 中內(nèi)毒素減少3-4個(gè)數(shù)量級(jí)。

 

4. 親和層析

 

親和層析技術(shù)利用與內(nèi)毒素具有高度特異性結(jié)合能力的配體，有效地從目標(biāo)蛋白質(zhì)中分離出內(nèi)毒素。這些配體通常針對(duì)內(nèi)毒素中最保守的脂質(zhì)A結(jié)構(gòu)進(jìn)行設(shè)計(jì)，其作用力包括疏水作用和靜電作用。

 

最常用的親和配體包括脫氧膽酸、二甲胺配體、組氨酸、多粘菌素B (PMB) 和聚陽離子配體等。

PMB：PMB是最常用的配體之一，一種對(duì)內(nèi)毒素具有高親和力的環(huán)狀脂肽。PMB可以誘導(dǎo)內(nèi)毒素聚集體的解離，并通過疏水相互作用與內(nèi)毒素的脂質(zhì) A部分結(jié)合。PMB層析柱的缺陷是可能會(huì)出現(xiàn)高于平均水平的產(chǎn)品損失，這是因?yàn)镻MB上的氨基酸基團(tuán)帶正電荷，可能會(huì)吸引帶負(fù)電荷的目標(biāo)分子。此外，PMB既有神經(jīng)毒性又有腎毒性，如果配體從填料中脫落可能會(huì)引起安全問題。

含氮堿基腺嘌呤、胞嘧啶、組氨酸和組胺都對(duì)內(nèi)毒素具有親和力。其中，組胺和組氨酸與PMB一樣有效，已成功將內(nèi)毒素與白蛋白、胰島素、溶菌酶、肌紅蛋白和其他物質(zhì)分離。許多重組蛋白都攜帶組氨酸標(biāo)簽，內(nèi)毒素和組氨酸的相互作用可能導(dǎo)致樣品污染，替代方法是使用其他如GST標(biāo)簽等。

商品化填料 (表2)：成本效益高的配體及其結(jié)合能力是純化過程中去除內(nèi)毒素的關(guān)鍵因素。聚-ε-賴氨酸和PMB是常用的兩種配體。表2匯總了這些配體相關(guān)商品化產(chǎn)品的內(nèi)毒素結(jié)合能力、蛋白質(zhì)回收率、可再生性和成本。

缺陷和新產(chǎn)品：上述樹脂的使用涉及重組蛋白回收率低，腎毒性和神經(jīng)毒性導(dǎo)致的靜脈應(yīng)用困難，填充床形式的多孔樹脂存在的高壓降和傳質(zhì)效率低等缺陷。已經(jīng)有研究開發(fā)出約800 nm的聚ε-己內(nèi)酯 (PCL) 納米粒子去除PBS緩沖液，蛋白質(zhì)溶液和水中的內(nèi)毒素。具有生物相容性好，剛性，無孔 (吸附發(fā)生在表面)，高內(nèi)毒素去除率 (99%) 和高回收率 (>95%) 等優(yōu)勢(shì)。

 

圖 4. 去除內(nèi)毒素的不同配基化學(xué)結(jié)構(gòu)

 

表 2. 層析法去除內(nèi)毒素的配體比較

 

5. 膜吸附

 

與傳統(tǒng)的柱層析技術(shù)相比，膜層析技術(shù)在提高生產(chǎn)流程速度和減少擴(kuò)散限制方面具有顯著優(yōu)勢(shì)。膜層析的膜材料可以選用多種不同的材料，包括纖維素、醋酸纖維素、尼龍、聚乙烯醋酸乙烯酯、聚乙烯醇和聚偏氟乙烯等。

 

案例分析一：已有研究報(bào)道使用固定化組氨酸標(biāo)簽的尼龍膜來清除內(nèi)毒素，但隨著初始內(nèi)毒素濃度的增加，其清除效率會(huì)逐漸降低。例如，在初始內(nèi)毒素濃度為387 EU/mL的最低水平時(shí)，清除效率也僅為65%。

 

案例分析二：一些研究人員已經(jīng)開發(fā)出一種新型的膜吸附劑，它不僅具有高效的內(nèi)毒素清除能力，還具有良好的結(jié)合性能。這種以聚偏氟乙烯（PVDF）為基材的吸附劑，通過添加兩親性碳質(zhì)顆粒，成功地從牛血清白蛋白溶液中清除了內(nèi)毒素，清除效率超過99.8%，同時(shí)蛋白質(zhì)的回收率也超過了90%。

 

表 3. 膜吸附用于內(nèi)毒素去除的比較

 

結(jié)論

 

對(duì)于能夠以較低成本生產(chǎn)高質(zhì)量產(chǎn)品技術(shù)的需求正在增加。對(duì)于使用革蘭氏陰性細(xì)菌生產(chǎn)的生物制藥來說，這一點(diǎn)尤其正確，因?yàn)閮?nèi)毒素污染是一個(gè)問題。基于動(dòng)物的內(nèi)毒素檢測(cè)技術(shù)將變得過時(shí)，取而代之的是電子生物傳感器和基于熒光的技術(shù)。需要實(shí)時(shí)在線監(jiān)測(cè)工藝流程中內(nèi)毒素濃度，以便對(duì)產(chǎn)品污染采取反饋措施，并保持生產(chǎn)生物制品和藥物的安全標(biāo)準(zhǔn)。開發(fā)同時(shí)檢測(cè)和去除內(nèi)毒素的方法，既要有效又要成本效率高，由于所需的高純度和內(nèi)毒素與目標(biāo)分子之間的潛在相互作用，這是一個(gè)持續(xù)的挑戰(zhàn)。親和層析是最有前途且應(yīng)用廣泛的內(nèi)毒素去除方法，因?yàn)閮?nèi)毒素和所選配體之間具有高度選擇性的相互作用。仍需進(jìn)行額外研究，以進(jìn)一步開發(fā)高效的內(nèi)毒素去除方法和具有高親和力、低成本和低毒性的靶向配體。這些創(chuàng)新將使產(chǎn)品質(zhì)量和產(chǎn)量提高，同時(shí)降低制造成本。