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摘  要 

腫瘤治療性mRNA疫苗作為一種新型腫瘤治療方式受到廣泛關(guān)注，目前多數(shù)產(chǎn)品正處于臨床前或臨床研究階段，國(guó)內(nèi)外尚無(wú)成熟的產(chǎn)品上市。由于腫瘤治療性mRNA疫苗的靶點(diǎn)特性、作用機(jī)制、遞送特征，以及人體與動(dòng)物免疫系統(tǒng)存在的差異，使得此類產(chǎn)品在非臨床試驗(yàn)設(shè)計(jì)和評(píng)價(jià)中情況更復(fù)雜。其中動(dòng)物模型的選擇不僅是非臨床有效性關(guān)注的內(nèi)容，也是毒性評(píng)價(jià)的關(guān)鍵考慮因素。本文從腫瘤治療性mRNA疫苗產(chǎn)品非臨床試驗(yàn)設(shè)計(jì)的角度，根據(jù)此類產(chǎn)品自身特點(diǎn)，通過(guò)分析、總結(jié)已開展臨床產(chǎn)品的非臨床研究，結(jié)合相關(guān)指導(dǎo)原則，探討此類產(chǎn)品非臨床評(píng)價(jià)關(guān)注的問(wèn)題。

2019年新型冠狀病毒肺炎暴發(fā)以來(lái)，全球積極開展疫苗研發(fā)工作，mRNA疫苗作為新一代疫苗受到廣泛關(guān)注。mRNA疫苗是利用抗原編碼信使RNA，通過(guò)特定的遞送系統(tǒng)使細(xì)胞攝取并表達(dá)編碼的抗原，從而引起體液和細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)的疫苗。使用mRNA疫苗技術(shù)研發(fā)新型治療性腫瘤疫苗，也為腫瘤治療帶來(lái)了新的機(jī)會(huì)。目前已有許多制藥企業(yè)已經(jīng)開展了腫瘤疫苗研發(fā)管線，部分產(chǎn)品進(jìn)入Ⅰ期和Ⅱ期臨床試驗(yàn)階段。腫瘤疫苗為腫瘤的治療帶來(lái)新的突破，也是繼腫瘤化療、放療、細(xì)胞免疫治療之后的新型治療方式。國(guó)內(nèi)外腫瘤治療性mRNA產(chǎn)品多處于臨床前或臨床研究階段。臨床進(jìn)展較快的為Moderna公司的mRNA-4157/V940，由編碼多達(dá)34種新抗原的單一合成mRNA分子組成，正在開展與程序性死亡受體-1（PD-1）抑制藥Keytruda聯(lián)合治療黑色素瘤的Ⅱb期臨床試驗(yàn)，結(jié)果可見一定的臨床獲益。

腫瘤治療性mRNA疫苗與預(yù)防性mRNA疫苗相比，存在給藥間隔縮短、給藥頻率增加或更長(zhǎng)的給藥周期等情況，腫瘤治療性疫苗多為細(xì)胞免疫激活特異性T細(xì)胞殺傷腫瘤，而預(yù)防性疫苗多以體液免疫為主，伴隨細(xì)胞免疫，免疫反應(yīng)類型不同。因此對(duì)腫瘤治療性mRNA疫苗在概念驗(yàn)證、組織分布、安全性研究及新輔料的研究與預(yù)防性mRNA疫苗存在一定差異。腫瘤治療性mRNA疫苗產(chǎn)品非臨床研究可參考的相關(guān)的指導(dǎo)原則有國(guó)家藥品監(jiān)督管理局于2021年12月發(fā)布的《基因治療產(chǎn)品非臨床研究與評(píng)價(jià)技術(shù)指導(dǎo)原則》，ICH S12《基因治療產(chǎn)品非臨床生物分布考慮》。本文通過(guò)分析已開展臨床產(chǎn)品的非臨床研究，結(jié)合相關(guān)指導(dǎo)原則，探討此類產(chǎn)品非臨床評(píng)價(jià)關(guān)注的問(wèn)題。

1、 受試物

非臨床研究用受試物應(yīng)能代表臨床擬用樣品，原則上應(yīng)考慮生產(chǎn)工藝流程、關(guān)鍵質(zhì)量特征及臨床擬用制劑等因素。若非臨床樣品輔料、生產(chǎn)工藝、生產(chǎn)場(chǎng)地等發(fā)生變更，應(yīng)進(jìn)行質(zhì)量對(duì)比研究，評(píng)估工藝變更對(duì)本品有效性及安全性的影響，必要時(shí)應(yīng)開展非臨床橋接研究，以提供產(chǎn)品的有效性和安全性的支持信息。

2、 有效性

2.1   概念驗(yàn)證研究

對(duì)于腫瘤治療性mRNA概念驗(yàn)證一般包括體外和體內(nèi)研究。體外應(yīng)進(jìn)行抗原表達(dá)、特異性T細(xì)胞激活或特異性腫瘤細(xì)胞殺傷等試驗(yàn)，評(píng)估受試物生物學(xué)活性及對(duì)作用機(jī)制的初步驗(yàn)證。體內(nèi)研究主要為在相關(guān)動(dòng)物模型上驗(yàn)證抗腫瘤活性獲得最低起效劑量，伴隨檢測(cè)特異性免疫T細(xì)胞表型、細(xì)胞因子等免疫相關(guān)指標(biāo)，進(jìn)一步驗(yàn)證本品有效性及作用機(jī)制。體內(nèi)有效性研究應(yīng)為臨床給藥途徑、給藥頻率提供支持性依據(jù)，為臨床起始劑量選擇提供參考。

對(duì)于一些mRNA產(chǎn)品，嚙齒類動(dòng)物（大鼠、小鼠）和非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物可能為非相關(guān)動(dòng)物種屬，因此在開展非臨床研究時(shí)可能采用動(dòng)物源基因樣品進(jìn)行試驗(yàn)。替代產(chǎn)品應(yīng)有與臨床擬用樣品相似的目的抗原表達(dá)、抗原遞呈、免疫系統(tǒng)特異性激活等作用。如：在目標(biāo)靶細(xì)胞中考查人源與鼠源產(chǎn)品的細(xì)胞轉(zhuǎn)染率及抗原表達(dá)量；動(dòng)物體內(nèi)試驗(yàn)考查動(dòng)物源產(chǎn)品激活T細(xì)胞的能力。對(duì)于編碼個(gè)性化腫瘤新生抗原的mRNA疫苗，如果無(wú)相關(guān)動(dòng)物種屬，替代產(chǎn)品可選擇動(dòng)物源腫瘤相關(guān)的抗原進(jìn)行編碼。對(duì)于采用動(dòng)物源替代產(chǎn)品開展體內(nèi)有效性研究?jī)H能在一定程度上評(píng)價(jià)遞送系統(tǒng)的遞送效果，不能提示抗原序列的抗腫瘤有效性特征。對(duì)于無(wú)相關(guān)動(dòng)物種屬而選用替代產(chǎn)品開展體內(nèi)有效性研究的產(chǎn)品，其體外功能活性及抗腫瘤作用是提示產(chǎn)品有效性的關(guān)鍵信息。

基于腫瘤適應(yīng)證復(fù)雜的免疫抑制機(jī)制，聯(lián)合治療是克服這一問(wèn)題的關(guān)鍵，常見的聯(lián)合策略有放化療與免疫治療聯(lián)合、靶向治療與免疫治療聯(lián)合等。對(duì)于mRNA治療性疫苗，如擬開展聯(lián)合給藥臨床試驗(yàn)，建議應(yīng)先在非臨床中驗(yàn)證聯(lián)合用藥帶來(lái)的獲益與風(fēng)險(xiǎn)，為臨床聯(lián)合用藥提供合理性依據(jù)。

2.2 動(dòng)物種屬/模型

選擇相關(guān)的動(dòng)物種屬/模型是開展體內(nèi)有效性試驗(yàn)的前提。相關(guān)動(dòng)物種屬選擇應(yīng)考慮動(dòng)物對(duì)表達(dá)抗原的免疫原性、藥理作用等，如受試物在動(dòng)物體內(nèi)表達(dá)的抗原不能引起特異性免疫反應(yīng)，則可能不是相關(guān)動(dòng)物種屬。腫瘤動(dòng)物模型選擇，應(yīng)根據(jù)擬申請(qǐng)適應(yīng)證（血液瘤或?qū)嶓w瘤）、目的抗原表達(dá)情況建立合適的荷瘤模型，可以是鼠源腫瘤模型或人源化小鼠荷瘤（人源腫瘤）模型。如對(duì)于編碼免疫刺激的產(chǎn)品，可以建立免疫系統(tǒng)人源化小鼠異種移植瘤模型，考查其在體內(nèi)刺激免疫系統(tǒng)發(fā)揮抗腫瘤作用機(jī)制。

3、 藥代動(dòng)力學(xué)

mRNA產(chǎn)品通常需開展體內(nèi)分布試驗(yàn)，應(yīng)采用合適的動(dòng)物種屬或模型，選擇臨床擬用給藥途徑，給予足夠的劑量開展，通常采用熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（qPCR）方法考查其在體內(nèi)靶組織及非靶組織的分布和清除，可選擇在腫瘤模型動(dòng)物中開展分布研究。組織分布取樣時(shí)間點(diǎn)應(yīng)能說(shuō)明藥物在體內(nèi)的復(fù)制特征，至少包括峰值和清除階段。替代產(chǎn)品的生物分布試驗(yàn)可能不足以反映臨床用樣品的生物分布特征，一般建議在合適的動(dòng)物模型中進(jìn)行臨床樣品生物分布研究。

4、 安全性

一般毒理學(xué)試驗(yàn)用于評(píng)估藥物毒性特征、毒性反應(yīng)可逆性、延遲毒性及劑量-毒性關(guān)系等，是新藥申請(qǐng)臨床試驗(yàn)的關(guān)鍵安全性試驗(yàn)，包括單次給藥毒性試驗(yàn)和重復(fù)給藥毒性試驗(yàn)。一般毒理學(xué)試驗(yàn)設(shè)計(jì)應(yīng)關(guān)注動(dòng)物種屬選擇、劑量設(shè)置、給藥周期、給藥頻率、動(dòng)物數(shù)量、對(duì)照選擇等問(wèn)題。動(dòng)物種屬一般選擇健康動(dòng)物，但在無(wú)相關(guān)動(dòng)物種屬時(shí)，可選擇腫瘤模型動(dòng)物開展毒理研究，如人免疫系統(tǒng)重建荷人源腫瘤模型等。根據(jù)產(chǎn)品特點(diǎn)在至少一種動(dòng)物種屬中開展毒理試驗(yàn)。重復(fù)給藥毒性試驗(yàn)應(yīng)獲得劑量-毒性反應(yīng)關(guān)系，選擇合適的給藥途徑、給藥頻率及周期為臨床試驗(yàn)方案提供支持性依據(jù)。安全性研究除常規(guī)指標(biāo)考察外，還應(yīng)關(guān)注免疫反應(yīng)引起的安全性擔(dān)憂，對(duì)含脂質(zhì)納米粒（LNP）等遞送系統(tǒng)的產(chǎn)品應(yīng)關(guān)注與遞送系統(tǒng)相關(guān)的毒性。

對(duì)于無(wú)相關(guān)動(dòng)物種屬的產(chǎn)品，且人源化重建動(dòng)物模型因模型原因死亡較多無(wú)法評(píng)價(jià)等情況，可考慮使用替代產(chǎn)品。替代產(chǎn)品的毒理學(xué)試驗(yàn)在反映產(chǎn)品安全性信息方面具有局限性，在于其可能與臨床擬用樣品存在質(zhì)量屬性、組織分布、作用機(jī)制等差異，不能全面提示臨床安全性風(fēng)險(xiǎn)及不能支持臨床起始劑量擬定，僅作為安全性評(píng)價(jià)的參考。

安全藥理學(xué)是評(píng)價(jià)產(chǎn)品對(duì)生理功能的潛在不良影響，一般包括心血管、呼吸和中樞神經(jīng)系統(tǒng)。一般來(lái)說(shuō)，對(duì)于mRNA疫苗類產(chǎn)品安全藥理學(xué)試驗(yàn)可單獨(dú)開展，也可結(jié)合在一般毒性試驗(yàn)中考查。如結(jié)合在一般毒性試驗(yàn)中，應(yīng)關(guān)注數(shù)據(jù)采集時(shí)間及檢測(cè)指標(biāo)。免疫原性、免疫毒性、局部刺激性等安全性試驗(yàn)也可結(jié)合重復(fù)給藥毒性試驗(yàn)進(jìn)行考察。

腫瘤治療性mRNA疫苗生殖毒性、致癌性試驗(yàn)可參考ICH S6《生物制品的臨床前安全性評(píng)價(jià)》、ICH S9《抗腫瘤藥物非臨床評(píng)價(jià)》等指導(dǎo)原則的相關(guān)建議。對(duì)于無(wú)法采用正常動(dòng)物開展生殖毒性研究的產(chǎn)品，可根據(jù)其作用特點(diǎn)、一般毒理發(fā)現(xiàn)、生物分布等信息綜合評(píng)估生殖毒性風(fēng)險(xiǎn)。

5、 新輔料

LNP是目前常用的遞送系統(tǒng)，制備LNP的脂質(zhì)成分、緩沖體系及相關(guān)成分可能影響顆粒整體質(zhì)量特性及有效性、安全性。因此，對(duì)于使用新脂質(zhì)成分或工藝重大變更的LNP，需對(duì)LNP進(jìn)行非臨床安全性研究。如含新陽(yáng)離子脂質(zhì)的LNP，應(yīng)對(duì)其新陽(yáng)離子脂質(zhì)成分或LNP進(jìn)行遺傳毒性研究，對(duì)LNP可伴隨疫苗或單獨(dú)開展必要的安全藥理及一般毒理試驗(yàn)。

6、 討論

腫瘤治療性mRNA疫苗作為一種新的腫瘤治療手段，雖然臨床試驗(yàn)正在積極開展，但總體仍處于開發(fā)初期。對(duì)于此類產(chǎn)品的非臨床試驗(yàn)方法、試驗(yàn)設(shè)計(jì)也處于不斷探索的階段，非臨床設(shè)計(jì)整體考慮也與其表達(dá)抗原、遞送載體等特性密切相關(guān)。

腫瘤治療性疫苗根據(jù)編碼產(chǎn)物可分為mRNA編碼免疫刺激劑、腫瘤相關(guān)抗原(TAA)、新抗原3種。①免疫刺激劑主要通過(guò)受體介導(dǎo)發(fā)送的信號(hào)調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)的質(zhì)量，可作為mRNA疫苗的編碼抗原增強(qiáng)機(jī)體的抗腫瘤免疫，常與其他免疫治療藥物共同使用，可編碼細(xì)胞因子包括白細(xì)胞介素-2（IL-2）、IL-23、IL-12、IL-15等。②mRNA編碼TAA是目前最常用的靶向抗原，將TAA作為抗原進(jìn)行編碼，從而達(dá)到對(duì)腫瘤細(xì)胞的靶向識(shí)別與殺傷效果。然而，其局限性在于TAA在正常組織細(xì)胞中也有表達(dá)，可能會(huì)引發(fā)免疫耐受或脫靶效應(yīng)；且TAA具有變異性，易發(fā)生免疫逃逸和耐藥。③mRNA編碼新抗原作為個(gè)性化治療。新抗原（neoantigen）廣義上是指由腫瘤細(xì)胞的突變基因所編碼產(chǎn)生的，能被機(jī)體免疫細(xì)胞所識(shí)別，并激活免疫應(yīng)答的一類異常表達(dá)的蛋白質(zhì)。新抗原疫苗是由非沉默體細(xì)胞突變產(chǎn)生的具有腫瘤特異性表達(dá)的 T 細(xì)胞表位，具有高免疫原性、個(gè)體化特性，在正常組織中不表達(dá)。接種新抗原疫苗既可以擴(kuò)大已有的新抗原特異性 T 細(xì)胞群，又可以在癌癥患者中誘導(dǎo)更廣泛的新特異性T細(xì)胞，從而發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng) 。

mRNA帶有負(fù)電荷，在體內(nèi)遞送需要穿越雙層脂膜跨膜負(fù)電位的屏障；在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，外源mRNA也存在著被核糖核酸酶降解的風(fēng)險(xiǎn)。mRNA腫瘤疫苗的傳統(tǒng)遞送方式包括病毒載體、體外負(fù)載DC等，而目前使用更廣泛的為納米脂質(zhì)材料載體。DC作為最強(qiáng)大的抗原提呈細(xì)胞，除誘導(dǎo)CD4+ T細(xì)胞免疫應(yīng)答以外，可將外源性抗原經(jīng)MHC-Ⅰ途徑交叉提呈，誘導(dǎo)CD8+ T細(xì)胞的免疫應(yīng)答。不足之處在于制備過(guò)程相對(duì)復(fù)雜，且易受到腫瘤異質(zhì)性和腫瘤抗原靶標(biāo)選擇的影響。LNP是目前轉(zhuǎn)染效率較高的遞送系統(tǒng)，LNP 脂質(zhì)殼結(jié)構(gòu)主要由膽固醇、中性磷脂、聚乙二醇 (PEG)-脂質(zhì)和可電離陽(yáng)離子脂質(zhì)組成，膽固醇穩(wěn)定 LNP中性磷脂支持脂質(zhì)雙層結(jié)構(gòu)并有助于溶酶體逃逸，PEG-脂質(zhì)能延長(zhǎng)疫苗的半衰期防止顆粒聚集，可電離脂質(zhì)在酸性條件下帶正電，通過(guò)靜電作用吸附負(fù)電性的 mRNA 形成復(fù)合物，是 mRNA 遞送和轉(zhuǎn)染效率的決定性因素。

藥物的非臨床評(píng)價(jià)對(duì)藥物的開發(fā)、使用具有重要的指導(dǎo)意義。腫瘤治療性mRNA疫苗作為一種創(chuàng)新性治療手段，研發(fā)中涉及的抗原選擇、概念驗(yàn)證、安全性評(píng)價(jià)、遞送系統(tǒng)都需經(jīng)過(guò)充分地研究，才能在腫瘤免疫治療方面取得突破。本文通過(guò)整理對(duì)腫瘤治療性mRNA疫苗非臨床評(píng)價(jià)的一般性問(wèn)題考慮，梳理審評(píng)中常見問(wèn)題，以期為腫瘤治療性mRNA疫苗的研發(fā)提供參考。