想象一下，在深邃的夜空中，星星點(diǎn)點(diǎn)的熒光如同遙遠(yuǎn)的星辰，照亮了我們對(duì)生命奧秘的探索之路。每一顆星星都像是科學(xué)家們?cè)趯?shí)驗(yàn)室中點(diǎn)燃的一盞盞明燈，指引著我們一步步走向未知的領(lǐng)域。而在微觀世界的舞臺(tái)上，間接免疫熒光技術(shù)宛如一雙慧眼，為我們揭示了細(xì)胞深處的秘密，讓原本隱藏在暗處的細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能展現(xiàn)在我們眼前。
在顯微鏡下，細(xì)胞內(nèi)各類蛋白質(zhì)和分子猶如夜空中的繁星，通過(guò)熒光標(biāo)記閃耀著獨(dú)特的光芒。間接免疫熒光技術(shù)不僅幫助我們精確定位這些分子的分布，還讓我們能夠觀察到它們?cè)谏顒?dòng)中的動(dòng)態(tài)變化。通過(guò)這一技術(shù)，科學(xué)家們能夠更深入地理解細(xì)胞的工作機(jī)制，從而為疾病的診斷和治療提供新的思路和方法。
跟隨筆者的腳步，我們將一起深入探索間接免疫熒光的奧秘，領(lǐng)略這一技術(shù)在現(xiàn)代生物學(xué)研究中的無(wú)窮魅力吧~
一、實(shí)驗(yàn)原理
間接免疫熒光是一種高度靈敏的免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)，它利用特異性抗體來(lái)檢測(cè)細(xì)胞或組織樣本中的特定抗原。通過(guò)使用未標(biāo)記的第一抗體特異性結(jié)合抗原，然后利用熒光標(biāo)記的第二抗體識(shí)別并結(jié)合第一抗體，從而在熒光顯微鏡下檢測(cè)和定位目標(biāo)抗原。
二、細(xì)胞系選擇
體外培養(yǎng)的貼壁生長(zhǎng)胃癌腫瘤細(xì)胞系：C*43-EGFP-BGC-823（穩(wěn)轉(zhuǎn)縫隙連接蛋白43）、EGFP-BGC-823（空載）。
三、實(shí)驗(yàn)步驟
1.對(duì)照組設(shè)置
確保陰性對(duì)照（無(wú)一抗或使用非特異性一抗）和陽(yáng)性對(duì)照（已知表達(dá)目標(biāo)抗原的細(xì)胞）的設(shè)置正確，以驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的特異性。
2.儀器兼容性檢查
確認(rèn)所使用的激光掃描共聚焦熒光顯微鏡的激光器激發(fā)波長(zhǎng)與二抗標(biāo)記的熒光染料的激發(fā)波長(zhǎng)相匹配，以確保有效激發(fā)和檢測(cè)。
3.細(xì)胞爬片制備
確保細(xì)胞培養(yǎng)條件適宜，如溫度、CO2濃度。細(xì)胞密度達(dá)到70%-80%時(shí)，細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，適合進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。對(duì)于膜蛋白，建議細(xì)胞密度達(dá)到90%以上。
4.細(xì)胞狀態(tài)檢查
在鏡檢時(shí)，選擇細(xì)胞狀態(tài)良好、分布均勻的爬片，用適量PBS洗3次，每次2min。
5.固定
根據(jù)目標(biāo)抗原的不同，選擇合適的固定劑和固定時(shí)間。例如，GFP通常使用多聚甲醛固定。確保PBS洗滌充分，避免固定劑殘留。本實(shí)驗(yàn)用冰甲醇(提前一天放-20℃預(yù)冷)固定2分鐘或4%PFA 室溫固定5分鐘。
6.通透
使用0.5% Triton X-100/PBS進(jìn)行細(xì)胞通透，時(shí)間控制在10-30分鐘，以確?？乖目稍L問(wèn)性。PBS洗3次，每次5min。
7.封閉
使用5% BSA/PBS或與二抗相同宿主的血清進(jìn)行封閉1h，以減少非特異性結(jié)合。
8.一抗孵育
確保一抗的稀釋比例適當(dāng)，以獲得最佳染色效果。根據(jù)抗體特性選擇孵育時(shí)間和溫度。一般是室溫或37℃約 1-2h 或4℃濕盒內(nèi)過(guò)夜。
9.洗滌
使用0.01% Triton X-100/PBS洗滌3次，每次5-10min，以去除未結(jié)合的一抗。
10.二抗孵育
確保二抗的稀釋比例適當(dāng)，使用封閉液稀釋。在孵育前，離心去除可能的聚集體。將熒光染料標(biāo)記二抗按合適的稀釋比稀釋到封閉液中，配好后離心20min，轉(zhuǎn)速 12000rpm，并加合適的量到蓋玻片上，孵育約1h。
11.洗滌
再次使用0.01% Triton X-100/PBS洗滌，去除未結(jié)合的二抗。
12.染核
加適量DAPI(終濃度一般為0.5-1ug/mL)染核5 min。
13.洗滌
繼續(xù)使用0.01% Triton X-100/PBS洗滌，去除DAPI殘留。
14.去離子水洗滌
使用去離子水洗滌以去除鹽結(jié)晶，避免影響顯微鏡下的觀察。
15.封片
確保封片劑的配比正確，甘油:PBS=9:1。在封片時(shí)，注意避免氣泡的產(chǎn)生，確保封片劑均勻覆蓋。具體操作是將略晾干的細(xì)胞爬片的細(xì)胞面朝下貼在載玻片上，用鑷子輕輕將氣泡趕出，用衛(wèi)生紙吸去周圍多余的液體，用指甲油封邊，晾干后(約20min)即可觀測(cè)，也可放4℃避光保存。
四、結(jié)果解析
圖片解析
1.胞核（藍(lán)色）：
藍(lán)色染色通常使用DAPI（4',6-diamidino-2-phenylindole）或Hoechst染料。這些染料能夠與DNA特異性結(jié)合，因此可以清晰地標(biāo)記出細(xì)胞核。
圖中可以看到每個(gè)細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞核呈現(xiàn)為藍(lán)色，細(xì)胞核形態(tài)清晰，可見(jiàn)多個(gè)核仁。
2.細(xì)胞骨架（綠色）：
綠色染色可能是通過(guò)FITC（異硫氰酸熒光素）標(biāo)記的抗體來(lái)染色的。綠色通常用來(lái)標(biāo)記細(xì)胞骨架中的微管或肌動(dòng)蛋白絲。
圖中綠色部分展示了細(xì)胞骨架的結(jié)構(gòu)，可以看到細(xì)胞的形狀和內(nèi)部結(jié)構(gòu)。
3.其他結(jié)構(gòu)（紅色）：
圖中還可以看到一些紅色的點(diǎn)狀結(jié)構(gòu)，這可能是其他熒光染料標(biāo)記的細(xì)胞器或蛋白質(zhì)，如線粒體或特定的細(xì)胞膜蛋白。
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