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前言

 

今年4月，Nature Review Drug Discovery雜志在文章“The antibody–drug conjugate landscape”中提到，抗體-藥物偶聯(lián)物（Antibody-drug conjugates, ADC）已成為腫瘤領(lǐng)域的一種關(guān)鍵治療方式，與多種適應(yīng)癥的標(biāo)準(zhǔn)治療和化療相比，其臨床表現(xiàn)優(yōu)越，因此預(yù)測上市和處于三期臨床開發(fā)的ADC藥物收入將在2028年達(dá)到260億美元[1]。全球癌癥發(fā)病率的上升也推動了對抗癌藥物的投資增加，促使ADC藥物市場大幅增長。盡管ADC藥物已經(jīng)成功上市15個(gè)，但其仍然面臨兩大主要挑戰(zhàn)：首先，經(jīng)驗(yàn)證的有效載荷作用機(jī)制單一，限制了可治療的疾病范圍；其次，非特異性和不充分的有效載荷傳遞限制了ADC的治療窗口。本文總結(jié)了從靶點(diǎn)、小分子毒素和連接子這三個(gè)設(shè)計(jì)維度的創(chuàng)新點(diǎn)，并重點(diǎn)介紹體外ADME在研究ADC藥物中建立的各個(gè)實(shí)驗(yàn)平臺及其應(yīng)用。

 

1、ADC藥物及研發(fā)創(chuàng)新

 

ADC藥物是將單克隆抗體經(jīng)過連接子與小分子毒素藥物偶聯(lián)形成的靶向藥物。ADC由三個(gè)部分組成：抗體、小分子毒素和連接子，各個(gè)組分需要具備對應(yīng)的特征，抗體需要有高特異性和低免疫原性；連接子要求在循環(huán)系統(tǒng)中穩(wěn)定，腫瘤環(huán)境中可有效釋放細(xì)胞毒素，小分子毒素則需要生理?xiàng)l件下穩(wěn)定，且對于腫瘤細(xì)胞有很強(qiáng)的殺傷力；理想的ADC藥物需在血液循環(huán)中保持穩(wěn)定，精準(zhǔn)到達(dá)治療目標(biāo)，并最終在目標(biāo)附近釋放細(xì)胞毒性。

 

圖1. ADC藥物的結(jié)構(gòu)[2]

 

1、靶點(diǎn)的創(chuàng)新

 

目前，從處于各個(gè)研發(fā)階段的ADC藥物可以看出，靶點(diǎn)主要集中在HER2、TROP2等常用靶點(diǎn)上。總體而言，約90%的靶點(diǎn)是在癌細(xì)胞上高表達(dá)的抗原，約10%的靶點(diǎn)與腫瘤微環(huán)境的獨(dú)特特征相關(guān)。新出現(xiàn)的靶點(diǎn)是一種纖維連接蛋白（FN）的額外結(jié)構(gòu)域B（EDB），纖維連接蛋白是一種普遍表達(dá)的高分子量細(xì)胞外基質(zhì)，其在正常組織中表達(dá)受限，在腫瘤組織中高表達(dá)。

 

圖2. EDB+FN蛋白在腫瘤間質(zhì)與正常組織中的表達(dá)差異[3]

 

該靶點(diǎn)在腫瘤間質(zhì)與正常組織中的表達(dá)差異如圖2所示。以甲狀腺和肝臟中表達(dá)為例，紫色框線是腫瘤間質(zhì)的表達(dá)量，綠色是正常組織的表達(dá)量，可以看出其明顯的差異化表達(dá)。目前有一款在研的ADC藥物PYX-201靶向纖維連接蛋白，在2024年美國癌癥大會上進(jìn)行了數(shù)據(jù)披露，治療效果較好[1]。

 

2、小分子毒素的創(chuàng)新

 

目前常用的小分子毒素作用機(jī)制是抗有絲分裂、拓?fù)洚悩?gòu)酶1抑制劑和DNA烷化劑，包括熟知的MMAE（微管抑制劑）、Dxd（拓?fù)洚悩?gòu)酶1抑制劑）等小分子毒素。新型的毒素是一種小分子降解劑，作用機(jī)理是選擇性降解GSPT1。GSPT1是多種腫瘤組織和細(xì)胞中顯著過表達(dá)的關(guān)鍵翻譯終止因子，小分子降解劑通過選擇性降解GSPT1進(jìn)而使得細(xì)胞凋亡，其具有高特異性、皮摩爾效力和靶向多種與癌癥相關(guān)的細(xì)胞內(nèi)蛋白的能力。目前在研的ADC藥物ORM-5029的有效載荷是高效選擇性GSPT1降解物。在臨床前研究的乳腺癌模型中，其抗癌活性與曲妥珠單抗（Enhertu）相似[1]。

 

3、連接子的創(chuàng)新

 

常用的連接子是二肽VC、四肽GGFG等，其可以通過組織蛋白酶進(jìn)行裂解。新興的連接技術(shù)不依賴于內(nèi)源性酶介導(dǎo)的切割，專注于外源性控制有效載荷的釋放。其原理是ADC與細(xì)胞外腫瘤靶點(diǎn)結(jié)合，然后靜脈注射外源化學(xué)探針（激活劑），選擇與ADC連接子快速反應(yīng)進(jìn)而釋放藥物，可以繞過對腫瘤生物學(xué)的依賴。在研的TGW101采用外源性化學(xué)激活劑來誘導(dǎo)有效載荷釋放，與VC二肽連接子相比，在結(jié)直腸癌和卵巢癌異種移植模型中顯示出優(yōu)越的抗腫瘤活性[1]。

 

通過三方面的創(chuàng)新點(diǎn)可以看出，ADC還有廣闊的發(fā)展空間，在研的很多藥物以傳統(tǒng)經(jīng)典的設(shè)計(jì)為主要導(dǎo)向，結(jié)合一些新的小分子毒素或者連接子等，將經(jīng)典和創(chuàng)新相互碰撞，設(shè)計(jì)出更加合理的ADC藥物。

 

2、ADC藥物的體外ADME研究

 

根據(jù)ADC藥物在體內(nèi)的代謝過程，藥明康德DMPK建立了對應(yīng)的測試平臺。在靜脈注射后，首先需要保證ADC藥物在循環(huán)系統(tǒng)中穩(wěn)定，為了評估該穩(wěn)定性，可以采用血漿/全血的研究體系；到達(dá)靶組織之后，利用抗體特異性結(jié)合抗原，經(jīng)過內(nèi)吞作用進(jìn)入腫瘤細(xì)胞，在溶酶體作用下裂解連接子，釋放細(xì)胞毒素導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，為了評估細(xì)胞毒素釋放機(jī)理，建立溶酶體、組織蛋白酶B、酸化肝勻漿和肝S9等測試體系；同時(shí)可以體外評估腫瘤靶細(xì)胞中細(xì)胞毒素的釋放能力及其殺傷力。通過這些評估，可以更清楚地了解循環(huán)系統(tǒng)的穩(wěn)定性和毒素釋放的機(jī)制，更加合理地設(shè)計(jì)ADC藥物。

 

1、血漿穩(wěn)定性研究

 

選取ADC藥物DS8201開展研究，其連接子和有效載荷是GGFG和Dxd，GGFG是常用的連接子，Dxd作用機(jī)制是拓?fù)洚悩?gòu)酶1抑制劑。

表1. DS8201 基本信息

通過和不同種屬的血漿及其含1%BSA的PBS孵育不同時(shí)間點(diǎn)直至21天，檢測血漿中Dxd的生成濃度并計(jì)算其釋放率。數(shù)據(jù)展示如下：

 

圖3. 不同種屬血漿和含1%BSA的PBS中Dxd的釋放濃度

 

表2. DS8201和血漿孵育21天后Dxd釋放濃度和釋放率

 

圖3呈現(xiàn)了DS8201在不同種屬血漿及其陰性對照組中payload釋放濃度，可以看出均有一定的釋放，但其釋放率都小于2%，說明其在循環(huán)系統(tǒng)中穩(wěn)定，與ADC設(shè)計(jì)的想法一致，孵育21天后的Dxd釋放濃度和申報(bào)材料中的差異在3倍以內(nèi)，說明血漿體系適合評估長時(shí)間的ADC的穩(wěn)定性?？紤]到Dxd在不同pH下有開環(huán)閉環(huán)兩種形式，該體系將會進(jìn)一步擴(kuò)展優(yōu)化。

 

2、ADC藥物在不同測試體系中payload釋放研究

 

維布妥昔單抗是2020年上市的一款A(yù)DC藥物，靶點(diǎn)為CD30, 連接子和毒素是經(jīng)典的VC二肽和MMAE。

 

表3.維布妥昔單抗基本信息

 

通過和組織蛋白酶B、肝溶酶體、肝勻漿、肝S9孵育不同時(shí)間點(diǎn)，檢測其MMAE的生成濃度并計(jì)算其釋放率。數(shù)據(jù)展示如下：

 

圖4. 不同基質(zhì)中MMAE的釋放濃度

 

圖4呈現(xiàn)其在不同測試體系孵育不同時(shí)間點(diǎn)后MMAE的釋放濃度曲線，可以看出在組織蛋白酶B和肝勻漿中，其釋放量類似，肝溶酶體和肝S9均有不同程度的釋放。所以探索ADC藥物中payload的釋放機(jī)理，根據(jù)不同連接子類型（二肽，四肽，葡萄糖苷鍵等），可以選擇不同的測試體系，以設(shè)計(jì)出更加合適的連接子。例如組織蛋白酶B是單一酶，裂解特定的連接子（VC,GGFG等），對于該類連接子可以直接用組織蛋白酶B進(jìn)行研究，溶酶體則是含有多種水解酶，可以水解外源性和內(nèi)源性的大分子，對于不明確裂解機(jī)理的連接子，可優(yōu)先選擇該體系。

 

結(jié)語

 

機(jī)遇和挑戰(zhàn)并存，未來ADC藥物的發(fā)展會朝向雙靶點(diǎn)ADC、雙載荷ADC及其新型的連接子方向，同時(shí)隨著小分子篩選和蛋白質(zhì)重組分子生物技術(shù)的進(jìn)步，藥物開發(fā)中出現(xiàn)了新的抗體偶聯(lián)模式，包括抗體片段-細(xì)胞毒素偶聯(lián)物、抗體-寡核苷酸偶聯(lián)物（AOC）等。藥明康德DMPK已建立不同的研究平臺以評估ADC藥物在循環(huán)系統(tǒng)穩(wěn)定性及其payload的釋放機(jī)理。面對“萬物皆可偶聯(lián)”的時(shí)代，藥明康德DMPK針對不同的偶聯(lián)技術(shù)，迎接挑戰(zhàn)，不斷豐富體外實(shí)驗(yàn)，建立了更多的評估平臺，如組織蛋白酶L/K、葡萄糖醛酸酶等研究連接子裂解效率，更好地服務(wù)ADC藥物的研發(fā)之路。

 

參考文獻(xiàn)：

 

[1] Patrick Flynn, Smruthi Suryaprakash, Dan Grossman, Val Panier & John Wu, The antibody–drug conjugate landscape. Nature Review Drug Discovery, 2024.

 

[2] Siler Panowski, et al, Site-specific antibody drug conjugates for cancer therapy. mAbs, 2014

 

[3] Sharon Wilks, et al, A First-in-Human Phase 1 Clinical Study Evaluating Safety, Tolerability, Pharmacokinetics, Pharmacodynamics and Efficacy of the EDB+FN targeting ADC PYX-201 in Participants with Advanced Solid Tumors. Poster. 

 

[4] NDA/BLA Multi-disciplinary Review and Evaluation. Center for Drug Evaluation and Research, 2019, Enhertu.