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細胞系基因敲低常見的方法包括：shRNA、siRNA、CRISPR/Cas系統(tǒng)及sgRNA，我主要分享shRNA敲低細胞系表達的方法，其大致原理為將shRNA連接到PLKO的質粒中，將質粒轉染進細胞，在細胞質中，質?？梢赞D錄出一段與目的基因互補的單鏈RNA，這條互補RNA與目的基因的mRNA互補結合后，會特異性的將目的基因的mRNA降解，從而使目的基因翻譯的模板減少，達到敲低目的基因的效果。

主要的方法步驟如下：

1.shRNA序列設計：

shRNA可在網頁在線設計，設計完成后送至公司合成。

2.shRNA序列退火

1)將公司合成的shRNA序列常溫4000rpm離心1min，按包裝管上的指示加入相應微升的超純水到相應的濃度，根據(jù)實驗所需取部分稀釋到10μmol。

2)水浴鍋提前設置到95℃，退火體系50μL按下表依次加入相應試劑，95℃退火4min。

3)退火完成后，等待水溫自然冷卻至手溫后，可將退火后的shRNA放入冰箱4℃暫存。

注意：shRNA合成后一般為粉末狀，合成公司不同處理方式不同，根據(jù)說明書處理即可。

3.雙酶切敲低載體PLKO

酶切位點的選擇提前進行查詢，常見酶切體系如下，37℃酶切1h。

4.瓊脂糖凝膠鑒定酶切結果

根據(jù)載體大小配置瓊脂糖凝膠并跑電泳，根據(jù)酶切片段計算片段出現(xiàn)的位置，以此判斷載體酶切是否成功，可能出現(xiàn)的結果如圖所示：

5.膠回收（根據(jù)回收試劑盒的操作步驟進行即可）

6.shRNA和酶切后的載體連接

連接體系10 μL，按下表依次加入相應試劑，振蕩混勻并離心，16℃連接4 h或過夜。

連接結束后將樣品放入冰箱4℃暫存。

7.連接產物轉化、搖菌、測序

連接產物轉化搖菌及提質粒均按常規(guī)步驟操作即可，質粒提取結束根據(jù)濃度取一定微升的原液送公司測序，查看載體構建是否成功。

8.慢病毒包裝、篩選

1)提前一天在6 cm培養(yǎng)皿中鋪HEK-293T細胞，保證第二天密度可達70%左右。

2)準備相應數(shù)量的高壓后的Ep管，加入慢病毒包裝質粒4 μg（PSA 3μg +PMD2G 1μg）、4 μg測序正確的質粒和200 mL Opti-MEM混勻（單個質粒），再加入24 μL PEI，輕輕混勻，室溫靜置10 min。

3)將提前一天鋪好的293T細胞換液，換成10% FBS轉染培養(yǎng)基1.5 mL，注意小心操作，盡量避免細胞懸浮。

4)靜置10 mins后，每Ep管中加入1 mL 10%FBS轉染培養(yǎng)基，輕輕混勻，將其全部輕輕加入培養(yǎng)皿中，4 h后換完全培養(yǎng)基 6mL。

5)轉染40 h后小心收集病毒上清，使用0.22 μm的過濾網進行過濾，過濾完成后冰箱4℃可短暫保存。

6)待構細胞提前一天使用6孔板鋪板，保證感染前細胞密度達60%以上，同時應選用狀態(tài)最好的細胞。

7)小心吸掉待構細胞6孔板中的原培養(yǎng)基，加入4 mL含嘌呤霉素（由載體本身決定）的細胞的培養(yǎng)基（嘌呤霉素終濃度為1.5 μg/mL），加入PBS濃度梯度稀釋好的病毒液，十字混勻后放入細胞培養(yǎng)箱。

8)6孔板每兩天換一次含嘌呤霉素的培養(yǎng)基2 mL，大約篩選一周對照組細胞死亡，穩(wěn)轉細胞成型。