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實(shí)驗(yàn)原理：

 

Pull-down實(shí)驗(yàn)是一種常用于研究蛋白質(zhì)相互作用的技術(shù)。其基本原理是利用蛋白質(zhì)之間的特異性相互作用來篩選和鑒定與感興趣蛋白相互作用的蛋白質(zhì)。在實(shí)驗(yàn)中，首先將感興趣的蛋白質(zhì)（通常是已知的蛋白質(zhì)）與特定的標(biāo)簽（如GST、HIS等）融合，并表達(dá)在宿主細(xì)胞中。然后，將這些標(biāo)記蛋白與細(xì)胞提取物或重組蛋白混合，使它們在體外環(huán)境中進(jìn)行相互作用。

 

在混合過程中，與標(biāo)記蛋白質(zhì)相互作用的其他蛋白質(zhì)會(huì)結(jié)合到標(biāo)記蛋白質(zhì)上形成復(fù)合物。未結(jié)合的蛋白質(zhì)被洗脫，留下與標(biāo)記蛋白質(zhì)相互作用的蛋白質(zhì)。最后，通過分析技術(shù)（如Western blotting、質(zhì)譜分析等），可以鑒定和定量與標(biāo)記蛋白質(zhì)相互作用的蛋白質(zhì)，從而揭示它們之間的相互作用。

 

Pull-down實(shí)驗(yàn)的基本原理是基于蛋白質(zhì)之間的特異性和親和性相互作用。通過選擇適當(dāng)?shù)臉?biāo)簽和實(shí)驗(yàn)條件，可以準(zhǔn)確地研究感興趣蛋白質(zhì)與其他蛋白質(zhì)之間的相互作用，從而深入了解這些相互作用在細(xì)胞功能中的作用機(jī)制。

 

 

Pull-down驗(yàn)證蛋白互作原理圖

 

實(shí)驗(yàn)步驟：

 

1、構(gòu)建載體

 

在進(jìn)行載體構(gòu)建時(shí)，通常會(huì)用常見的蛋白質(zhì)標(biāo)簽，如GST（谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶）、HIS（組氨酸富集標(biāo)簽）、MBP（麥芽糖結(jié)合蛋白）等。這些標(biāo)簽對應(yīng)著多種載體，常見的有PET系列（如pET-28a）和PGEX系列載體（如pGEX-4T1）。

 

2、檢測蛋白表達(dá)

 

1）將構(gòu)建好的載體轉(zhuǎn)化到BL21大腸桿菌菌株。

 

2）將BL21菌種進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，待細(xì)菌培養(yǎng)至OD值達(dá)到0.6-0.8時(shí)，加入IPTG（異丙基硫代半乳糖苷），以誘導(dǎo)蛋白表達(dá)。

 

3）誘導(dǎo)結(jié)束后，收集菌體并加入PBS緩沖液，然后使用超聲破碎儀進(jìn)行細(xì)胞破碎。

 

4）破碎后，12000r離心，收集細(xì)胞上清，并加入5×Loading buffer，煮10分鐘。

 

5）通過Western blot技術(shù)檢測蛋白表達(dá)效果。

 

3、蛋白大規(guī)模培養(yǎng)及純化鑒定

 

經(jīng)過上述蛋白表達(dá)預(yù)實(shí)驗(yàn)，確定了適宜的IPTG誘導(dǎo)濃度、誘導(dǎo)時(shí)間和誘導(dǎo)溫度后，可以進(jìn)行蛋白的大規(guī)模培養(yǎng)。

 

1）收集全部培養(yǎng)上清，如果目標(biāo)蛋白帶有GST標(biāo)簽，可以利用GST成品純化柱進(jìn)行純化處理。

 

2）考馬斯亮藍(lán)染色：取2微克GST-A和HIS-B蛋白，加入適量5×loading buffer，進(jìn)行100℃煮沸10分鐘，然后進(jìn)行蛋白電泳。

 

3）蛋白電泳結(jié)束后，切割凝膠，并加入考馬斯亮藍(lán)染色液，過夜染色。

 

4）用脫色液脫色凝膠，清洗，直到背景清晰，拍照留存。

 

4、Pull-down實(shí)驗(yàn)

 

1）安裝柱子并用PBS平衡柱子。

 

2）向一個(gè)封閉的GST柱子中加入2毫升的GST-A，并在4℃下旋轉(zhuǎn)混合6小時(shí)。

 

3）流出孵育液，用已預(yù)冷的350毫升1×PBS洗滌GST柱子約15次（每次加入10毫升PBS后，蓋好蓋子顛倒混勻，然后打開流出），保持在4℃。

 

4）在GST-A孵育的柱子中吸取50微升的介質(zhì)，加入5×loading buffer后煮沸10分鐘，作為Input，4℃?zhèn)溆?，用于檢測GST-A是否成功掛在柱子上。

 

5）向柱子中加入2毫升的HIS-B，在4℃下過夜孵育，并取50微升的蛋白作為HIS-B，加入loading buffer后煮沸10分鐘作為質(zhì)控，4℃?zhèn)溆谩?/span>

 

6）流出孵育液后，用預(yù)冷的1×PBS洗滌柱子約15次。

 

7）取50微升的介，加入5× loading buffer后煮沸10分鐘，4℃?zhèn)溆?，用于檢測HIS-B蛋白是否與GST-A蛋白發(fā)生相互作用。

 

結(jié)果分析：

 

1）考馬斯亮藍(lán)檢測

 

2）Western blot驗(yàn)證

 

注意事項(xiàng)：

 

1）由于不同的蛋白在不同載體上的表達(dá)效果各異，有些可能會(huì)表達(dá)在包涵體中，導(dǎo)致難以純化。因此，有時(shí)需要對載體進(jìn)行改造，以促進(jìn)蛋白的溶解和表達(dá)。在這個(gè)過程中，需要進(jìn)行不同的載體構(gòu)建嘗試，以尋找最適合的表達(dá)條件。

 

2）在誘導(dǎo)過程中，需要設(shè)置不同濃度的IPTG（如0.3、0.5、0.7等）、不同誘導(dǎo)時(shí)間（可暫定為16小時(shí)或12小時(shí)等）以及不同的誘導(dǎo)溫度（如28℃或16℃等），以尋找最佳的表達(dá)條件。

 

3）離心過程中的轉(zhuǎn)速也會(huì)影響蛋白表達(dá)情況，因此需要確定一個(gè)合適的轉(zhuǎn)速。

 

4）在準(zhǔn)備細(xì)胞裂解液時(shí)，需添加蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑，以保護(hù)蛋白質(zhì)的完整性。

 

5）在所有步驟中，尤其是蛋白相互作用和洗脫步驟中，應(yīng)該保持低溫，通常在冰上進(jìn)行，以防止蛋白的非特異性結(jié)合降解。