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前言

 

寡核苷酸是一類單鏈或雙鏈的小合成核酸聚合物，可作用于基因表達水平進而調節(jié)蛋白質功能，以達到治療疾病的目的。繼化學小分子和單克隆抗體藥物之后，寡核苷酸藥物因其在RNA水平上調控疾病基因轉錄翻譯的獨特機制，可以填補一些罕見、難治愈并還未攻克的疾病治療領域，其研發(fā)得到了快速發(fā)展。近年來，全球已有14個寡核苷酸藥物獲得上市批準，70多個寡核苷酸藥物II期或III期臨床試驗正在進行中，覆蓋罕見病、難治愈疾病等多個治療領域[1]。

 

與傳統(tǒng)小分子藥物一樣，寡核苷酸藥物在臨床前研究階段，通常需要進行體外代謝穩(wěn)定性研究。目前所有已上市的寡核苷酸藥物均在申報材料中提交了藥物的體外代謝研究報告，以闡明藥物的代謝能力。本文主要介紹了寡核苷酸藥物的代謝酶、體外代謝研究方法以及研究策略，為寡核苷酸新藥研發(fā)提供參考。

 

1、寡核苷酸藥物簡介

 

寡核苷酸藥物（Oligonucleotides, Oligo）是由人工化學合成的12～30個核糖寡核苷酸單鏈或雙鏈組成的一類藥物，通過Watson-Crick堿基配對原則作用于目標信使RNA (mRNA)[2]，主要分為反義寡核苷酸藥物（Antisense Oligonucleotides, ASOs）和小干擾RNA藥物（Small Interference RNA, siRNA）兩大類。作為新一類藥物分子，寡核苷酸藥物極性大、帶電荷、需要借助化學修飾和遞藥系統(tǒng)改善成藥性，因而具有不同于化學小分子的藥理學特征。未經化學修飾的寡核苷酸藥物成藥性通常不理想，它們具有較差的PK特性，比如穩(wěn)定性差，易被核酸酶降解；極性大，對目標RNA的結合親和力不佳。為了達到臨床效用，寡核苷酸必須經過化學改造。

 

細胞內遞送：

 

與分子質量約7kDa的ASOs相比，分子質量約14kDa的雙鏈siRNA因為較大分子體積和親水性，經細胞攝取有限。為了增加細胞攝取，siRNA通常連接靶向配體，比如N-乙酰半乳糖胺（N-acetylgalactosamine, GalNAc）或包裹在脂質納米粒中。（具體遞送策略可參考公眾號：寡核苷酸藥物的“智能”遞送。）

 

作用機制：

 

寡核苷酸藥物通過Waston-Crick 配對，以高選擇性、親和性和目標RNA結合，利用內源性核酸酶降解目標RNA，或通過立體阻斷核糖體機制調節(jié)RNA剪接和翻譯過程。目前，臨床在研的siRNA有10多個采取納米顆粒包裹運載，更多的是采取siRNA-GalNAc技術。（具體作用機制可參考公眾號：寡核苷酸藥物的代謝及代謝產物分析和鑒定研究。）

 

2、寡核苷酸藥物的體外代謝研究方法

 

已上市的寡核苷酸藥物主要被血漿和組織中廣泛存在的核酸內切酶和核酸外切酶所代謝，而不是通過肝臟的Ⅰ相和Ⅱ相代謝酶代謝[3]。核酸外切酶作用于鏈的末端，導致單核苷酸的釋放，而核酸內切酶則在鏈內裂解，產生不同長度的鏈。例如，ASOs隨血流循環(huán)至全身，超過80%的藥物分布在肝臟和腎臟，主要經血液和組織中的核酸外切酶和內切酶代謝[4]，原型和核酸酶代謝產物主要經尿液排泄[5]。siRNA主要分布器官同樣為肝臟和腎臟，與大多數(shù)ASOs藥物不同，siRNA藥物除了需要化學修飾避免核酸酶降解，還需要遞藥系統(tǒng)的庇護進入靶器官，免于被腎臟排泄和核酸酶降解。

 

由于寡核苷酸藥物特殊的作用機制，以及在細胞水平上發(fā)揮基因沉默作用的過程的復雜性，對該類藥物提出了新的挑戰(zhàn)。

 

2.1肝勻漿代謝穩(wěn)定性實驗

 

目前上市的寡核苷酸藥物大部分被肝臟迅速攝取，小部分分布在其他組織，在肝臟或其他組織中經由核酸酶代謝。肝組織勻漿液（肝勻漿）是通過將肝組織破碎并均質化得到的，方便獲取、儲存和運輸，它含有肝組織中的各種藥物代謝酶。肝勻漿可用于寡核苷酸藥物的代謝研究，通過將藥物加入肝勻漿中，可以在實驗室條件下模擬藥物在體內的代謝過程。實驗中孵育液的pH、終止方法和勻漿濃度都對勻漿代謝結果具有一定的影響，故將從以上三個方面對肝勻漿代謝模型進行探索。

 

孵育液pH對勻漿代謝結果的影響

 

Patisiran分別在孵育液pH為5.0、6.0和7.0的條件下，與人肝勻漿在水浴中孵育適當?shù)臅r間（如1、2、4、6和24小時）后，左圖反義鏈（AS）和右圖正義鏈（SS）代謝穩(wěn)定性結果如圖1所示。結果表明，隨著pH的升高，化合物Patisiran反義鏈和正義鏈的代謝速率降低。

 

圖1. Patisiran在不同pH的人肝勻漿中的代謝穩(wěn)定性

 

Inclisiran和Vutrisira在不同pH條件下呈現(xiàn)同樣的趨勢，如Vutrisira在孵育液pH為5.0、6.0和7.0的條件下，與人肝勻漿在水浴中孵育24小時后，正義鏈的剩余率分別為16.1%、23.0%、106.7%。

 

終止方式對勻漿代謝結果的影響

 

Patisiran與人肝勻漿水浴孵育24小時，分別用OTX (SPE)、NP40 (SPE)和NH4OH (LLE)三種方式進行反應終止以及樣品處理[6, 7]，實驗結果如圖2所示。結果表明，三種終止方式的終止效果無明顯區(qū)別。相較于固相萃取（SPE），液相萃?。↙LE）耗材成本較低，優(yōu)先使用該方法。

 

圖2. Patisiran在不同終止方式的人肝勻漿中的代謝穩(wěn)定性

 

勻漿濃度對勻漿代謝的影響

 

0.1 mg/mL、0.5 mg/mL、1.0 mg/mL、2.0 mg/mL和 5.0 mg/mL 的五種人肝勻漿與 Patisiran水浴孵育24小時，實驗結果如圖3所示，結果表明，Patisiran在不同濃度的人肝勻漿中，其代謝趨勢略有區(qū)別。

 

圖3. Patisiran在不同濃度人肝勻漿中的代謝穩(wěn)定性

 

測試化合物在人肝勻漿中的代謝趨勢

 

測試化合物Patisiran、Inclisiran、Vutrisiran在人肝勻漿酸性條件下，37℃水浴孵育24小時，實驗結果如圖4所示，測試化合物在人肝勻漿中有明顯代謝趨勢。Patisiran反義鏈和正義鏈均有較明顯的代謝趨勢，Inclisiran和Vutrisiran的正義鏈代謝速度明顯快于反義鏈。

 

圖4. 測試化合物在人肝勻漿中的代謝穩(wěn)定性

 

綜上所述，我們建立了肝勻漿的模型用于評估寡核苷酸藥物的體外代謝。

 

2.2血漿代謝穩(wěn)定性實驗

 

血漿作為一種常用的體外基質，方便獲取、儲存和運輸，可模擬藥物在體內循環(huán)系統(tǒng)的穩(wěn)定性，因此常被廣泛用于藥物開發(fā)的各個階段。血漿中含有豐富的核酸酶，所以在寡核苷酸的研究中評估血漿穩(wěn)定性至關重要。通過對實驗設計進行不斷優(yōu)化，采用兩個商品化siRNA與大鼠、猴和人血漿；5個商品化ASOs與小鼠、猴和人血漿分別孵育24小時之后，將其剩余量和文獻數(shù)據(jù)進行對比，發(fā)現(xiàn)具有較高的一致性。實驗結果如表格1和2中所示。

 

表1. 5個商品化ASOs孵育24小時的剩余率數(shù)據(jù)

表2. 2個商品化siRNA孵育24小時的剩余率數(shù)據(jù)

 

通過以上體外剩余率數(shù)據(jù)和體內的剩余率或者半衰期數(shù)據(jù)對比，可以看出體內體外的一致性，寡核苷酸可以通過體外血漿穩(wěn)定性實驗來評估體內循環(huán)系統(tǒng)的穩(wěn)定性。

 

2.3肝S9代謝穩(wěn)定性試驗

 

按照肝勻漿代謝模型探索條件進行肝S9試驗設計，以確定最終孵育條件。

 

測試化合物Patisiran、Inclisiran、Vutrisiran在人肝S9酸性條件下，37℃水浴孵育24小時，實驗結果如圖5所示，測試化合物在人肝S9中的代謝趨勢和在人肝勻漿中的代謝趨勢具有較高的一致性。

 

圖5. 寡核苷酸在人肝S9中的代謝穩(wěn)定性

 

2.4其他基質的代謝穩(wěn)定性試驗

 

寡核苷酸藥物一般基于平臺進行開發(fā)，體外代謝研究同樣基于寡核苷酸藥物的結構特點，選擇不同的體系。按照肝勻漿代謝模型探索條件進行其他基質的試驗設計，以確定最終孵育條件。

 

3、寡核苷酸藥物的代謝研究策略

 

和傳統(tǒng)小分子藥物一樣，在藥物臨床前研究階段，通常需要進行體外的代謝穩(wěn)定性研究，以評估寡核苷酸藥物的穩(wěn)定性。充分理解該類藥物的代謝特性，有助于早期臨床試驗設計更合理，加快該類藥物的上市。一般體內給藥后，寡核苷酸藥物先進入血液循環(huán)，然后在肝、腎等器官中發(fā)生代謝和排泄。目前上市的寡核苷酸藥物大部分被肝臟迅速攝取，小部分分布在其他組織，在肝臟或其他組織中經由核酸酶代謝，肝臟作為主要代謝器官，在寡核苷酸藥物體外穩(wěn)定性研究中占主要部分，其次是腎臟。

 

經過實驗研究發(fā)現(xiàn)，通過體外血漿中孵育，可獲得寡核苷酸藥物在血中水解酶或核酸酶作用下的代謝穩(wěn)定性情況。通過肝勻漿孵育，可獲得與體內靶組織相近的代謝穩(wěn)定性行為。同時，通過體外模型如S9、溶酶體等可進一步評估寡核苷酸藥物在靶組織中的穩(wěn)定性。

 

參考文獻：

 

[1] Oligonucleotide Therapeutics: From Discovery and Development to Patentability；Pharmaceutics 2022, 14, 260

 

[2] Bennett CF. Therapeutic antisense oligonucleotides are comingof age [J]. Annu Rev Med, 2019, 70: 307-321

 

[3] Andersson, P. & Den Besten, C. CHAPTER 20: Preclinical and Clinical Drug-metabolism, Pharmacokinetics and Safety of Therapeutic Oligonucleotides. RSC Drug Discov. Ser. 2019-January, 474–531 (2019)

 

[4] Geary RS. Antisense oligonucleotide pharmacokinetics and metabolism [J]. Expert Opin Drug Metab Toxicol, 2009, 5: 381-391.

 

[5] Mustonen EK, Palomaki T, Pasanen M. Oligonucleotide-based pharmaceuticals: non-clinical and clinical safety signals and nonclinical testing strategies [J]. Regul Toxicol Pharmacol, 2017, 90: 328-341.

 

[6] Molecular Therapy: Nucleic Acids Vol. 21 September 2020. 725~736

 

[7] Metabolism of Antisense Oligonucleotides in Rat Liver Homogenates; JPET 292:140–149, 2000