您當(dāng)前的位置：檢測(cè)資訊 > 生產(chǎn)品管
嘉峪檢測(cè)網(wǎng) 2024-11-01 18:38
灌流培養(yǎng)作為一種連續(xù)細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，較傳統(tǒng)批量生產(chǎn)工藝有利于企業(yè)生產(chǎn)成本控制，并可根據(jù)供應(yīng)需求靈活調(diào)整規(guī)模。本文對(duì)比了傳統(tǒng)批量發(fā)酵工藝與灌流工藝，明確了灌流培養(yǎng)工藝特點(diǎn)。結(jié)合國(guó)際人用藥品注冊(cè)技術(shù)協(xié)會(huì)目前正在起草的指導(dǎo)原則，本文從細(xì)胞傳代穩(wěn)定性研究、批次及規(guī)模定義、生產(chǎn)工藝控制、外源因子控制、生產(chǎn)工藝驗(yàn)證等方面，總結(jié)了灌流培養(yǎng)工藝藥學(xué)評(píng)價(jià)的考量?jī)?nèi)容。
重組蛋白類(lèi)生物制品原液的生產(chǎn)傳統(tǒng)上分為2個(gè)主要步驟: 上游( 細(xì)胞培養(yǎng)和目標(biāo)蛋白的表達(dá)) 和下游( 蛋白的純化和制備成原液) 。隨著重組蛋白生物制品行業(yè)發(fā)展，人們對(duì)重組蛋白類(lèi)生物制品的質(zhì)量屬性和工藝?yán)斫馊諠u累積，加之行業(yè)競(jìng)爭(zhēng)日益激烈、成本壓力增大、法規(guī)政策的變化等，部分重組蛋白類(lèi)生物制品企業(yè)正在逐漸探索將傳統(tǒng)的批量生產(chǎn)變更為連續(xù)制造。灌流培養(yǎng)是一種連續(xù)細(xì)胞培養(yǎng)工藝，目前，已有多個(gè)采用灌流培養(yǎng)工藝進(jìn)行生產(chǎn)的重組生物制品在我國(guó)獲批上市［1］，對(duì)于灌流培養(yǎng)工藝的藥學(xué)評(píng)價(jià)，仍有待制定更為系統(tǒng)的技術(shù)要求，目前國(guó) 際 人 用 藥 品 注 冊(cè) 技 術(shù) 協(xié) 調(diào) 會(huì) ( InternationalCouncil on Harmonisation，ICH) 指導(dǎo)原則《原料藥和制劑的連續(xù)制造》正在征求公眾意見(jiàn)階段，尚未發(fā)布正式版本［2］。美國(guó) FDA 曾經(jīng)就小分子和固體口服制劑的連續(xù)生產(chǎn)質(zhì)控考量點(diǎn)發(fā)布了指導(dǎo)原則征求意見(jiàn)稿，提及部分考量要點(diǎn)也可供生物制品參考［3］。此外，美國(guó) FDA 就治療用生物制品連續(xù)生產(chǎn)工藝中病毒去除/滅活的小規(guī)模驗(yàn)證問(wèn)題進(jìn)行了研究，并發(fā)表了研究論文［4］。我國(guó)尚無(wú)相關(guān)的指導(dǎo)原則可供參考，筆者根據(jù)實(shí)際工作經(jīng)驗(yàn)，并結(jié)合 ICH 相關(guān)指導(dǎo)原則，在本文中討論了上游采用灌流工藝進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)，下游仍采用常規(guī)非連續(xù)批生產(chǎn)純化模式的原液生產(chǎn)工藝的藥學(xué)評(píng)價(jià)考量，以期對(duì)相關(guān)企業(yè)提供可供借鑒的參考。
1、灌流培養(yǎng)工藝特點(diǎn)
目前重組生物制品常見(jiàn)的發(fā)酵模式為批量培養(yǎng): 批培養(yǎng)和補(bǔ)料批培養(yǎng)。在批培養(yǎng)生產(chǎn)模式下，細(xì)胞經(jīng)接種、擴(kuò)增后，在生物反應(yīng)器中生長(zhǎng)和表達(dá)，直到由于培養(yǎng)基消耗達(dá)到極限，細(xì)胞密度和活率開(kāi)始下降。補(bǔ)料批培養(yǎng)發(fā)酵中，通過(guò)在培養(yǎng)過(guò)程中的不同時(shí)間點(diǎn)添加補(bǔ)料避免營(yíng)養(yǎng)耗竭，因此，培養(yǎng)時(shí)間比批處理模式更長(zhǎng)，最終生產(chǎn)率提高。無(wú)論是批培養(yǎng)還是補(bǔ)料批培養(yǎng)，隨著培養(yǎng)過(guò)程的延長(zhǎng)，由于細(xì)胞代謝產(chǎn)物會(huì)不斷累積、滲透壓會(huì)不斷改變等原因，一方面會(huì)使生物反應(yīng)器中細(xì)胞密度及活細(xì)胞比例在達(dá)到一定數(shù)量后降低導(dǎo)致目的蛋白產(chǎn)量降低; 另一方面由于培養(yǎng)環(huán)境的改變，可能導(dǎo)致細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)的改變，從而會(huì)影響產(chǎn)物質(zhì)量的均一性。灌流培養(yǎng)過(guò)程是一種持續(xù)向生物反應(yīng)器添加新鮮培養(yǎng)基，同時(shí)通過(guò)細(xì)胞保留裝置截留細(xì)胞，持續(xù)分離含有目的產(chǎn)物和代謝產(chǎn)物的收獲液的培養(yǎng)方式，因此可提供對(duì)細(xì)胞穩(wěn)定且有利的生長(zhǎng)環(huán)境，維持細(xì)胞密度和較高、較長(zhǎng)的發(fā)酵時(shí)間［5］。相較于批培養(yǎng)及補(bǔ)料批培養(yǎng)模式，灌流培養(yǎng)可以在高細(xì)胞密度環(huán)境下長(zhǎng)時(shí)間維持穩(wěn)定培養(yǎng)環(huán)境［6-7］。
在生產(chǎn)規(guī)模方面，批培養(yǎng)和補(bǔ)料批培養(yǎng)規(guī)模相對(duì)固定，若要提高生產(chǎn)規(guī)模需要通過(guò)新增生產(chǎn)線或新增產(chǎn)地等方式開(kāi)展。而灌流培養(yǎng)生產(chǎn)規(guī)模可以通過(guò) 4 個(gè)方面進(jìn)行規(guī)模放大: ① 在不改變收獲液流速和設(shè)備情況下變更運(yùn)行時(shí)間。② 在不改變整體運(yùn)行時(shí)間和設(shè)備情況下增加收獲液流量。③ 增加設(shè)備( 平行) 放大。④ 通過(guò)增加設(shè)備容量來(lái)放大規(guī)模。因此相對(duì)于批培養(yǎng)和補(bǔ)料批培養(yǎng)，灌流培養(yǎng)的生產(chǎn)當(dāng)時(shí)更加靈活，有助于重組蛋白生物制品生產(chǎn)企業(yè)根據(jù)供應(yīng)需求靈活調(diào)整規(guī)模［2］。批量培養(yǎng)的操作相對(duì)簡(jiǎn)單，且工業(yè)界目前對(duì)于批量培養(yǎng)的工藝及工藝控制有較多的實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)，而灌流培養(yǎng)工藝對(duì)于工藝和過(guò)程的控制較復(fù)雜，且部分依賴于高度自動(dòng)化的設(shè)備。灌流模式有利于工藝規(guī)模結(jié)合實(shí)際需求進(jìn)行靈活調(diào)整，但需要大量的前期研究及驗(yàn)證工作來(lái)支持工藝規(guī)模的靈活調(diào)整。此外，由于灌流生產(chǎn)工藝發(fā)酵時(shí)間較長(zhǎng)，對(duì)生產(chǎn)用細(xì)胞穩(wěn)定傳代能力有更高的要求［5，8］。
2、灌流培養(yǎng)的藥學(xué)審評(píng)考量
2.1體外細(xì)胞傳代周期限度
灌流培養(yǎng)工藝的細(xì)胞傳代周期限度的確定基本原則同批量培養(yǎng)一致，應(yīng)結(jié)合小規(guī)模傳代穩(wěn)定性研究和實(shí)際生產(chǎn)終末代細(xì)胞的研究綜合確定。對(duì)于小規(guī)模的細(xì)胞傳代穩(wěn)定性研究應(yīng)該能夠體現(xiàn)灌流發(fā)酵特點(diǎn)，通常的連續(xù)傳代培養(yǎng)方法不能體現(xiàn)該工藝特點(diǎn)，可以利用線性縮小的生物反應(yīng)器模擬實(shí)際生產(chǎn)開(kāi)展連續(xù)培養(yǎng)以研究生產(chǎn)過(guò)程中的細(xì)胞傳代穩(wěn)定性。在細(xì)胞傳代穩(wěn)定性研究期間，一方面應(yīng)確保小規(guī)模的工藝參數(shù)能模擬實(shí)際工藝參數(shù); 另一方面，因灌流培養(yǎng)通常可維持較長(zhǎng)時(shí)間的發(fā)酵，因此小規(guī)模的發(fā)酵天數(shù)應(yīng)覆蓋實(shí)際生產(chǎn)的最大天數(shù)。在考察項(xiàng)目方面，除常規(guī)考察項(xiàng)目外，由于灌流培養(yǎng)不同時(shí)間產(chǎn)物質(zhì)量可能存在一定差異，因此不僅要考察培養(yǎng)結(jié)束時(shí)產(chǎn)物的質(zhì)量(純度、糖基化、活性、雜質(zhì)) 及遺傳物質(zhì)穩(wěn)定性，還應(yīng)該取發(fā)酵不同時(shí)間段的產(chǎn)物進(jìn)行產(chǎn)物質(zhì)量及遺傳物質(zhì)穩(wěn)定性的研究，以更好反映連續(xù)灌流培養(yǎng)不同時(shí)間點(diǎn)產(chǎn)物特點(diǎn)，為下游合批、分批提供依據(jù)。此外，還應(yīng)對(duì)實(shí)際發(fā)酵的不同過(guò)程中間體進(jìn)行產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)測(cè)，并對(duì)生產(chǎn)終末代細(xì)胞進(jìn)行遺傳穩(wěn)定性確認(rèn)，并按照藥典要求開(kāi)展生產(chǎn)終末代細(xì)胞檢定，以進(jìn)一步結(jié)合實(shí)際工藝對(duì)細(xì)胞限傳周期的限度進(jìn)行合理控制。
若采用灌流培養(yǎng)時(shí)存在側(cè)傳培養(yǎng)，則對(duì)于側(cè)傳培養(yǎng)細(xì)胞的傳代穩(wěn)定性研究中還應(yīng)結(jié)合側(cè)傳培養(yǎng)工藝開(kāi)展側(cè)傳培養(yǎng)的細(xì)胞傳代穩(wěn)定性研究，應(yīng)將側(cè)傳培養(yǎng)與非側(cè)傳培養(yǎng)的細(xì)胞及產(chǎn)物進(jìn)行橫向比較，考察側(cè)傳培養(yǎng)工藝是否會(huì)影響發(fā)酵的工藝及產(chǎn)品質(zhì)量，結(jié)合研究結(jié)果合理確定側(cè)傳培養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)條件、傳代周期限制等。
2.2生產(chǎn)用原材料
對(duì)于灌流培養(yǎng)工藝生產(chǎn)用原材料的控制除應(yīng)按照藥典《生物制品原材料及輔料質(zhì)量控制》對(duì)生產(chǎn)用原材料進(jìn)行分級(jí)控制外，考慮到部分培養(yǎng)基、緩沖液可能需要在配置后長(zhǎng)時(shí)間放置備用，因此對(duì)于放置期間微生物限度、內(nèi)毒素及原材料質(zhì)量的變化情況應(yīng)開(kāi)展研究和控制，以確保不會(huì)因?yàn)樵牧衔廴净蛸|(zhì)量的改變對(duì)灌流工藝造成非預(yù)期的工藝波動(dòng)。
2.3生產(chǎn)工藝
2.3.1 原液工藝規(guī)模和批次確定
為了便于批次溯源和工藝控制，應(yīng)根據(jù)工藝情況明確灌流培養(yǎng)的規(guī)模，灌流培養(yǎng)原液的規(guī)模可以是相對(duì)固定的，也可以定義為一個(gè)范圍。對(duì)于批次方面，起始自同一細(xì)胞庫(kù)的一支或同時(shí)復(fù)蘇多支生產(chǎn)用細(xì)胞，經(jīng)過(guò)既定的擴(kuò)增、發(fā)酵后，經(jīng)單次或多次收獲得到的發(fā)酵產(chǎn)物，根據(jù)供應(yīng)需求或下游純化規(guī)模，可加工成一批或多批原液。
對(duì)于發(fā)酵規(guī)模的確定方面，幾種常見(jiàn)的灌流培養(yǎng)模式的考量如下。
2.3.1.1 生物反應(yīng)器數(shù)量固定，發(fā)酵天數(shù)固定
這種情況下灌流的放液速度通常是固定的工藝參數(shù)范圍，因此收獲液的總體積相對(duì)固定，發(fā)酵規(guī)模相對(duì)固定，在發(fā)酵階段應(yīng)結(jié)合反應(yīng)器數(shù)量、發(fā)酵天數(shù)，說(shuō)明每批收獲液的規(guī)模。
2.3.1.2 生物反應(yīng)器數(shù)量固定，發(fā)酵天數(shù)不固定
這種情況下要明確生物反應(yīng)器的數(shù)量、產(chǎn)物收獲的時(shí)間范圍，相應(yīng)地說(shuō)明收獲液的產(chǎn)量范圍。
2.3.1.3 生物反應(yīng)器數(shù)量不固定，發(fā)酵天數(shù)固定
這種情況下，首先要確定發(fā)酵的時(shí)長(zhǎng)和生物反應(yīng)器的數(shù)量范圍，其次要關(guān)注是否所有生物反應(yīng)器都是同時(shí)進(jìn)行發(fā)酵，對(duì)于存在側(cè)傳培養(yǎng)的發(fā)酵工藝，可能各個(gè)生物反應(yīng)器發(fā)酵起始時(shí)間不完全相同，要關(guān)注所有生物反應(yīng)器是各自固定發(fā)酵時(shí)間，還是所有生物反應(yīng)器在同一時(shí)間結(jié)束發(fā)酵。
2.3.1.4 生物反應(yīng)器數(shù)量不固定，發(fā)酵時(shí)間不固定
這種情況下相對(duì)比較復(fù)雜，要確定生物反應(yīng)器的數(shù)量范圍和發(fā)酵時(shí)間的范圍，考慮是否存在側(cè)傳，應(yīng)確保各個(gè)生物反應(yīng)器的細(xì)胞傳代均在限制范圍內(nèi)。
灌流培養(yǎng)的原液生產(chǎn)，在收獲和純化階段可能存在多步分批、合批操作，為了更加準(zhǔn)確表達(dá)分批、合批策略，可采用圖示的方法對(duì)涉及分批、合批的工藝步驟進(jìn)行說(shuō)明，并對(duì)不同階段的規(guī)模，允許分批、合批的總操作次數(shù)進(jìn)行說(shuō)明。為了確保產(chǎn)品的可溯源性及產(chǎn)品的批間一致性，應(yīng)建立良好的物料可追溯性、工藝監(jiān)測(cè)和物料分流策略。有研究表明在培養(yǎng)基、培養(yǎng)條件、起始細(xì)胞等相同的情況下，與批量培養(yǎng)工藝相比，灌流培養(yǎng)產(chǎn)品的異質(zhì)性程度較低，但灌流培養(yǎng)過(guò)程中隨著生產(chǎn)用細(xì)胞胞齡的延長(zhǎng)，細(xì)胞代謝同樣會(huì)發(fā)生一定程度的改變，進(jìn)而造成不同胞齡產(chǎn)物的糖基化等翻譯后修飾類(lèi)型和比例、聚體和片段等雜質(zhì)的相對(duì)含量也會(huì)發(fā)生變化［5］。對(duì)于重組治療用生物制品而言，質(zhì)量屬性的差異可能對(duì)安全性、有效性產(chǎn)生影響，因此在分批、合批的過(guò)程中要結(jié)合實(shí)際監(jiān)測(cè)結(jié)果考慮源自不同胞齡來(lái)源中間體合適比例的混批，為了確?；炫螽a(chǎn)品質(zhì)量符合后續(xù)加工要求，確保工藝的批間一致性能力，可考慮采用合適的質(zhì)量指標(biāo)對(duì)混批后中間產(chǎn)品進(jìn)行過(guò)程控制，結(jié)合工藝能力設(shè)置可接受范圍。
2.3.2 原液生產(chǎn)工藝
2.3.2.1 工藝參數(shù)及過(guò)程控制
灌流培養(yǎng)工藝需要維持較長(zhǎng)時(shí)間的動(dòng)態(tài)穩(wěn)態(tài)培養(yǎng)環(huán)境，工藝的穩(wěn)健性依賴于有效的工藝和過(guò)程控制，應(yīng)基于工藝研究在合適的時(shí)間對(duì)工藝參數(shù)和過(guò)程產(chǎn)物的質(zhì)量屬性進(jìn)行監(jiān)控。對(duì)于灌流工藝的工藝控制分為在線檢測(cè)和離線檢測(cè) 2 種方法，企業(yè)可以根據(jù)工藝和監(jiān)控需求選擇 1 種或多種不同的過(guò)程檢測(cè)技術(shù)，對(duì)發(fā)酵過(guò)程中的工藝參數(shù)及中間產(chǎn)物進(jìn)行多角度的監(jiān)測(cè)。對(duì)于過(guò)程控制檢測(cè)，一方面需考慮方法的時(shí)效性; 另一方面，對(duì)于在線檢測(cè)方法還應(yīng)關(guān)注檢測(cè)方法本身是否會(huì)增加污染風(fēng)險(xiǎn)。隨著技術(shù)的發(fā)展，越來(lái)越多的技術(shù)被運(yùn)用到灌流培養(yǎng)的過(guò)程檢測(cè)中，例如: 高效液相色譜和質(zhì)譜具有高靈敏度和準(zhǔn)確性，用于在線檢測(cè)時(shí)，可以識(shí)別和定量代謝物、目的蛋白和宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)［8］。
擴(kuò)增階段: 由于擴(kuò)增階段細(xì)胞的活率、密度等會(huì)影響后續(xù)發(fā)酵中細(xì)胞的生長(zhǎng)和生產(chǎn)能力，因此應(yīng)對(duì)擴(kuò)增階段進(jìn)行監(jiān)測(cè)。對(duì)于工藝參數(shù)及中間產(chǎn)物監(jiān)測(cè)的考量與批培養(yǎng)模式相似。但對(duì)于有側(cè)傳培養(yǎng)的發(fā)酵工藝，為確保側(cè)傳培養(yǎng)的細(xì)胞在后續(xù)增殖及生產(chǎn)過(guò)程中生長(zhǎng)屬性與非側(cè)傳培養(yǎng)細(xì)胞一致，降低產(chǎn)品質(zhì)量屬性的異質(zhì)性，應(yīng)通過(guò)充分地研究確定側(cè)傳培養(yǎng)細(xì)胞的種子細(xì)胞來(lái)源及側(cè)傳培養(yǎng)細(xì)胞將接種于哪一步工藝，制定相關(guān)工藝參數(shù)的控制范圍。
發(fā)酵階段: 灌流培養(yǎng)工藝中 N 生物反應(yīng)器通常是先進(jìn)行擴(kuò)增，達(dá)到一定穩(wěn)態(tài)后( 如達(dá)到預(yù)設(shè)的細(xì)胞密度) ，進(jìn)入發(fā)酵生產(chǎn)。發(fā)酵生產(chǎn)后又分為 2 種不同的情況，部分工藝從進(jìn)入發(fā)酵生產(chǎn)后就開(kāi)始收獲發(fā)酵產(chǎn)物，部分工藝在發(fā)酵生產(chǎn)一段時(shí)間后開(kāi)展收獲發(fā)酵產(chǎn)物，因此 N 階段的工藝參數(shù)應(yīng)分別說(shuō)明擴(kuò)增階段和發(fā)酵階段的工藝參數(shù)。通常認(rèn)為該階段的關(guān)鍵工藝參數(shù)除關(guān)注不同階段培養(yǎng)基、細(xì)胞密度、溶氧量、代謝產(chǎn)物濃度等工藝參數(shù)外，對(duì)于灌流培養(yǎng)工藝特有的工藝參數(shù)包括灌流速率、細(xì)胞放流速率、產(chǎn)物放出速率、發(fā)酵開(kāi)始時(shí)間等也非常關(guān)鍵，因此建議對(duì)相關(guān)工藝參數(shù)可允許的范圍進(jìn)行充分研究。對(duì)于發(fā)酵一段時(shí)間后開(kāi)始收獲的工藝，還應(yīng)制定明確、可行的用于判斷合格發(fā)酵液的監(jiān)控標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)于不合格發(fā)酵液的分流應(yīng)有明確的規(guī)定，以防止影響后續(xù)產(chǎn)品的加工。
在過(guò)程控制方面，鑒于不同胞齡產(chǎn)品質(zhì)量屬性方面可能存在差異，此外工藝參數(shù)的波動(dòng)也可能給產(chǎn)品質(zhì)量屬性帶來(lái)差異，因此應(yīng)選取合適的檢測(cè)頻率、取樣點(diǎn)及敏感的關(guān)鍵質(zhì)量屬性對(duì)發(fā)酵過(guò)程進(jìn)行控制，并結(jié)合工藝開(kāi)發(fā)及臨床試驗(yàn)結(jié)果，設(shè)置合理的過(guò)程控制可接受限度，確保發(fā)酵工藝處于受控狀態(tài)。若有必要，可根據(jù)過(guò)程監(jiān)控結(jié)果對(duì)工藝參數(shù)進(jìn)行調(diào)整，以確保目的產(chǎn)物的質(zhì)量，但調(diào)整的范圍應(yīng)有充分的研究數(shù)據(jù)支持，以防止造成發(fā)酵工藝不可控的波動(dòng)［2］。對(duì)于發(fā)酵階段微生物限度、內(nèi)毒素、支原體、外源因子等過(guò)程控制，若不能做到各個(gè)代表性階段取樣檢測(cè)，至少應(yīng)在代表最差的條件下取樣，通常認(rèn)為發(fā)酵時(shí)間越長(zhǎng)污染的可能性越大，可結(jié)合實(shí)際工藝情況考慮在發(fā)酵結(jié)束時(shí)取樣。若同時(shí)運(yùn)行多個(gè)發(fā)酵罐，為了最大限度地控制污染，可考慮對(duì)每個(gè)發(fā)酵罐的生產(chǎn)終末收獲液進(jìn)行外源因子檢測(cè)。
收獲階段: 對(duì)于灌流培養(yǎng)，發(fā)酵和收獲是并行的，用于灌流培養(yǎng)的收獲方式可通過(guò)切向流過(guò)濾(tangential flow filtration，TFF) 和替代切向流過(guò)濾(alternating tangential flow filtration，ATF) 完成，收獲過(guò)程中還可能使用超聲降沉裝置。對(duì)于某些雙特異性單抗或融合蛋白，收獲過(guò)程不僅是簡(jiǎn)單的分離過(guò)程，若過(guò)程參數(shù)設(shè)置不合理，可能對(duì)產(chǎn)物質(zhì)量造成影響，例如: 較高的剪切力可能造成蛋白片段的增加。因此，需要結(jié)合收獲方式，確定相關(guān)工藝參數(shù)的合理控制范圍［8］。對(duì)于多個(gè)發(fā)酵罐并行的灌流發(fā)酵工藝，收獲階段可能采取每個(gè)發(fā)酵罐的產(chǎn)品單獨(dú)收獲、貯藏，也可能多個(gè)發(fā)酵罐在同一時(shí)間段的收獲液合并收獲。不同收獲方式各有利弊，單個(gè)發(fā)酵罐單獨(dú)收獲有利于產(chǎn)品溯源，多個(gè)發(fā)酵罐同胞齡的產(chǎn)物合并收獲時(shí)，同一集液裝置中目的蛋白質(zhì)量的同質(zhì)性相對(duì)較高，應(yīng)結(jié)合下游合批、分批策略選擇合適的產(chǎn)物收集方式。由于灌流培養(yǎng)是一種維持時(shí)間較長(zhǎng)的發(fā)酵過(guò)程，因此第一批收獲物可能要經(jīng)過(guò)一定時(shí)間的貯藏，應(yīng)關(guān)注收獲產(chǎn)物的貯存容器及貯存條件對(duì)目的蛋白質(zhì)量的影響。
純化階段: 對(duì)于純化工藝采用非連續(xù)純化工藝的生產(chǎn)，通常灌流培養(yǎng)工藝與批培養(yǎng)或補(bǔ)料批培養(yǎng)的純化步驟相比，灌流培養(yǎng)因產(chǎn)物較多，第一步層析工藝(通常為親和層析) 需要處理大量的收獲液，層析填料循環(huán)次數(shù)和再生次數(shù)通常不一致，要分別對(duì)層析填料或?yàn)V膜的循環(huán)次數(shù)和再生次數(shù)開(kāi)展相應(yīng)的研究。此外，與補(bǔ)料批培養(yǎng)的工藝步驟相比，灌流培養(yǎng)工藝下游的非連續(xù)純化中，存在較多分批、合批操作，關(guān)于純化過(guò)程分批、合批的考量已在上文論述，不再重復(fù)論述。
2.3.3 原液生產(chǎn)工藝驗(yàn)證
采用灌流工藝生產(chǎn)的原液工藝驗(yàn)證相對(duì)比較復(fù)雜，除常規(guī)的批次數(shù)量的考慮外，為了支持較靈活的生產(chǎn)規(guī)模調(diào)整模式，可能需要在發(fā)酵工藝驗(yàn)證過(guò)程中考慮發(fā)酵時(shí)長(zhǎng)是否覆蓋了不同培養(yǎng)時(shí)長(zhǎng)，細(xì)胞擴(kuò)增過(guò)程中是否覆蓋了側(cè)傳培養(yǎng)(如果有側(cè)傳培養(yǎng)) ，是否覆蓋了生物反應(yīng)器的最大和最小運(yùn)行數(shù)量，來(lái)源于一瓶細(xì)胞和同時(shí)來(lái)源于多瓶的產(chǎn)物質(zhì)量是否存在差異，同一發(fā)酵罐的不同胞齡產(chǎn)物之間是否存在差異，以及存在差異的質(zhì)量屬性有哪些。在純化工藝驗(yàn)證中，對(duì)多次分批、合批操作，除了驗(yàn)證合批、分批最大批次及操作外，還應(yīng)對(duì)可能涉及的中間體重復(fù)過(guò)濾、凍融等情況進(jìn)行驗(yàn)證，對(duì)中間體貯存的穩(wěn)定性及相容性進(jìn)行充分評(píng)估。驗(yàn)證過(guò)程中應(yīng)通過(guò)一系列工藝及過(guò)程控制項(xiàng)目證明在不同生產(chǎn)模式下，工藝具有穩(wěn)健性，通過(guò)放行、擴(kuò)展的質(zhì)量研究及穩(wěn)定性研究數(shù)據(jù)證明產(chǎn)品具有批間一致性。
對(duì)于病毒去除/滅活工藝驗(yàn)證，應(yīng)結(jié)合發(fā)酵工藝和純化工藝最差條件，參考 ICH Q5A 開(kāi)展驗(yàn)證［9］。對(duì)層析步驟開(kāi)展病毒去除/滅活工藝驗(yàn)證時(shí)，考慮工藝參數(shù)代表性、中間樣品代表性、層析填料循環(huán)及再生次數(shù)。
2.4其他
制劑工藝開(kāi)始，灌流培養(yǎng)工藝與補(bǔ)料批培養(yǎng)工藝無(wú)明顯差異，關(guān)注點(diǎn)相同。在質(zhì)量研究和穩(wěn)定性考察方面，要特別關(guān)注代表性原液(如含有側(cè)傳培養(yǎng)工藝、中間體反復(fù)凍融等) 加工成的制劑批次質(zhì)量和穩(wěn)定性變化趨勢(shì)。
3、總結(jié)與挑戰(zhàn)
商業(yè)化的治療用重組蛋白生物制品生產(chǎn)必須具有批間一致、質(zhì)量可控、產(chǎn)量滿足商業(yè)生產(chǎn)的要求，但生物制品在發(fā)酵過(guò)程中很容易因?yàn)榄h(huán)境變化或細(xì)胞自身代謝狀態(tài)的變化造成在細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外的修飾類(lèi)型及水平等發(fā)生變化，從而導(dǎo)致產(chǎn)品的異質(zhì)性［1］。灌流培養(yǎng)工藝雖然相對(duì)于批次培養(yǎng)工藝能夠維持較長(zhǎng)時(shí)間的發(fā)酵時(shí)長(zhǎng)，但需要大量的前期研究來(lái)確定合適的工藝參數(shù)來(lái)確保動(dòng)態(tài)穩(wěn)定發(fā)酵狀態(tài)的維持，并對(duì)工藝中無(wú)菌工藝的維持能力要求較高。
此外，灌流培養(yǎng)對(duì)于培養(yǎng)基消耗量較大，也一定限度限制了灌流工藝的發(fā)展。灌流培養(yǎng)工藝作為一種連續(xù)生產(chǎn)工藝，也是生物制品連續(xù)制造中非常重要的一部分，對(duì)于生物制品的連續(xù)生產(chǎn)，我國(guó)在監(jiān)管方面目前經(jīng)驗(yàn)較少，未來(lái)需要落實(shí)或制定相關(guān)的法規(guī)或技術(shù)文件。無(wú)論從產(chǎn)業(yè)界還是監(jiān)管層面，對(duì)于灌流培養(yǎng)工藝的研究和控制有待進(jìn)一步積累相關(guān)工藝知識(shí)。
參考文獻(xiàn)
［1］ KAＲST DJ，STEINEBACH F，MOＲBIDELLI M． Continuous integrated manufacturing of therapeutic proteins［J］． Curr Opin Biotechnol，2018，53: 76 － 84．
［2］ ICH． Continuous manufacturing of drug substances and drug products( draft version) ［EB/OL］． ( 2021 － 07 － 27) ［2022 － 10 －11］． https: / /database． ich． org /sites/default /files/ICH _ Q13 _Step2_DraftGuideline_%202021_ 0727． pdf．
［3］ FDA． Quality considerations for continuous manufacturing guidancefor industry ( draft guidance) ［EB/OL］． ( 2019) ［2022 － 10 － 11］．https: / /www． fda． gov /regulatory-information /search-fda-guidancedocuments/quality-considerations-continuous-manufacturing．
［4］ FDA． Impact of continuous manufacturing processes on the viralsafety of therapeutic proteins［EB/OL］． ［2021］． https: / /www．fda． gov /drugs/regulatory-science-action /impact-continuous-manufacturing-processes-viral-safety-therapeutic-proteins．
［5］ BIELSEＲ JM，CHAPPUISA L，XIAO Y，et al． Perfusion cell culture for the production of conjugated recombinant fusion proteinsreduces clipping and quality heterogeneity compared to batchmodeprocesses［J］． J Biotechnol，2019，302: 26 － 31．
［6］ BIELSEＲ JM，WOLF M，SOUQUET J，et al． Perfusion mammalian cell culture for recombinant protein manufacturing-a critical review［J］． Biotechnol Adv，2018，36( 4) : 1328 － 1340．
［7］ 蘇爽，金永杰，黃瑞晶，等． 哺乳動(dòng)物細(xì)胞灌流培養(yǎng)工藝研究進(jìn)展［J］． 中國(guó)生物工程雜志，2019，39( 3) : 105 － 110．
［8］ CHEN C，WONG HE，GOUDAＲ CT． Upstream process intensification and continuous manufacturing［J］． Curr Opin Chem Eng，2018，22: 191 － 198．
［9］ ICH． Viral safety evaluation of biotechnology products derived fromcell lines of human or animal origin［EB/OL］． ( 1998) ［2022 － 10 －11］． https: / /www． ich． org /products/guidelines/quality /article /quality guidelines． html．
本文作者邱曉、賽文博、寇雅真、韋薇，國(guó)家藥品監(jiān)督管理局藥品審評(píng)中心，來(lái)源于中國(guó)新藥，僅供交流學(xué)習(xí)。由“制藥工藝與裝備”平臺(tái)整理發(fā)布，版權(quán)歸原作者所有，如有侵權(quán)請(qǐng)聯(lián)系刪除。歡迎關(guān)注“制藥工藝與裝備”公眾號(hào)，獲得最新制藥業(yè)創(chuàng)新技術(shù)、新聞動(dòng)態(tài)等熱點(diǎn)話題。
來(lái)源：Internet
關(guān)于我們 聯(lián)系我們 營(yíng)業(yè)執(zhí)照 全國(guó)服務(wù)電話：400-818-0021 嘉峪檢測(cè)版權(quán)所有 備案號(hào)：京ICP備14047019號(hào)-2 
京公網(wǎng)安備11010802046783號(hào)
