中文字幕一级黄色A级片|免费特级毛片。性欧美日本|偷拍亚洲欧美1级片|成人黄色中文小说网|A级片视频在线观看|老司机网址在线观看|免费一级无码激情黄所|欧美三级片区精品网站999|日韩av超碰日本青青草成人|一区二区亚洲AV婷婷

一、PCR實(shí)驗(yàn)概述

 

PCR，即多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，是一種簡(jiǎn)單便捷且高效的DNA擴(kuò)增技術(shù)。在PCR實(shí)驗(yàn)中，往往會(huì)出現(xiàn)一些異常問(wèn)題，以下對(duì)常見(jiàn)的一些問(wèn)題進(jìn)行了分析，并給出了解決方案，希望對(duì)大家有所幫助。

 

二、常見(jiàn)問(wèn)題及解決方案

 

1、假陽(yáng)性

 

原因：可能是引物特異性不好/靶序列太短或引物太短或者靶序列或擴(kuò)增產(chǎn)物出現(xiàn)交叉污染。

 

方案：

 

（1）引物設(shè)計(jì)完成以后，應(yīng)對(duì)其進(jìn)行BLAST檢測(cè)。如果與其它基因不具有互補(bǔ)性，就可以進(jìn)行下一步的實(shí)驗(yàn)；

 

（2）除酶及不能耐高溫的物質(zhì)外，所有試劑或器材均應(yīng)高壓消毒；

 

（3）操作時(shí)應(yīng)小心輕柔，防止將靶序列吸入加樣槍內(nèi)或?yàn)R出離心管外；

 

（4）各種試劑最好先進(jìn)行分裝，然后低溫貯存。

 

2、假陰性，不出現(xiàn)擴(kuò)增條帶

 

 

原因：引物設(shè)計(jì)有問(wèn)題或者引物濃度不對(duì)或引物發(fā)生降解；模板含有抑制物，含量；Buffer對(duì)樣品不合適；反應(yīng)條件：退火溫度太高，延伸時(shí)間太短。

 

方案：

 

（1）引物引物的濃度不僅要看OD值，更要注重引物原液做瓊脂糖凝膠電泳，一定要有引物條帶出現(xiàn)，而且兩引物帶的亮度應(yīng)大體一致；

 

（2）純化模板或者使用試劑盒提取模板DNA或加大模板的用量；

 

（3）更換Buffer或調(diào)整濃度；

 

（4）重新設(shè)計(jì)引物（避免鏈間二聚體和鏈內(nèi)二級(jí)結(jié)構(gòu)）或者換一管新引物；

 

（5）降低退火溫度、延長(zhǎng)延伸時(shí)間。

 

3、非特異性擴(kuò)增帶 

 

 

原因：引物與靶序列不完全互補(bǔ)，引物有二聚體；退火溫度過(guò)低，PCR循環(huán)次數(shù)過(guò)多；模板或引物濃度過(guò)高；Mg2+濃度偏高。

 

方案：

 

（1）降低引物量，適當(dāng)增加模板量，減少循環(huán)次數(shù)；

 

（2）降低鎂離子濃度；

 

（3）適當(dāng)提高退火溫度或使用二階段溫度法；

 

（4）減少循環(huán)次數(shù)。

 

4、拖尾—產(chǎn)物在凝膠上呈Smear狀態(tài)

 

 

 

原因：模板不純；Buffer不合適；退火溫度偏低；dNTP、Mg 2+濃度偏高；循環(huán)次數(shù)過(guò)多。

 

方案：

 

（1）純化模板；

 

（2）更換Buffer；

 

（3）適當(dāng)提高退火溫度；

 

（4）適當(dāng)降低dNTP和鎂離子的濃度；

 

（5）減少循環(huán)次數(shù)。

 

5、帶大小與預(yù)期理論值不一致

 

原因：污染問(wèn)題；模板或引物使用不當(dāng)；基因的不同亞型。

 

方案：

 

（1）實(shí)驗(yàn)中的污染可能會(huì)干擾PCR產(chǎn)物的大小。為了避免這種情況，應(yīng)使用全新的試劑和槍頭，并徹底清潔實(shí)驗(yàn)工作臺(tái)，確保實(shí)驗(yàn)環(huán)境的潔凈；

 

（2）重新選擇并使用正確的引物和模板DNA；

 

（3）遺傳多樣性可能導(dǎo)致目標(biāo)基因存在不同的亞型，這些亞型在序列上的差異可能會(huì)影響PCR產(chǎn)物的大小。對(duì)目標(biāo)基因進(jìn)行詳細(xì)的序列分析和使用BLAST等生物信息學(xué)工具進(jìn)行相似性搜索，可以幫助識(shí)別并考慮這些基因亞型的影響。