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疫苗類產(chǎn)品的安全性評價(jià)是個(gè)很大的話題，盡量在一篇文章中能提綱挈領(lǐng)的說清要點(diǎn)。當(dāng)然，首先要遵循的還是各類指南，NMPA（原SFDA）、FDA、EMA、ICH和WHO出臺了很多指導(dǎo)性文件，清單羅列如下。

 

與傳統(tǒng)生物藥相比，針對感染性疾病的疫苗最大的不同在于供試品為外源性蛋白或糖類，與人體或動(dòng)物源成分幾乎沒有任何同源性。非感染性疾病則相反，如腫瘤疫苗，針對的主要是內(nèi)源性蛋白或新生抗原，非感染性疫苗的非臨床安全性評價(jià)不在本次討論之列。

 

疫苗主要的毒理學(xué)研究終點(diǎn)與小分子化藥和傳統(tǒng)生物藥相似，但也有其特別之處，比如需要考察動(dòng)物是否產(chǎn)生了預(yù)期的特異性免疫反應(yīng)。除了標(biāo)準(zhǔn)毒理研究，根據(jù)疫苗類型和適應(yīng)癥，需要開展額外毒理研究，比如神經(jīng)毒性和生物分布。此外，對于種屬選擇、給藥方式、非抗原疫苗組分、佐劑、給藥裝置、注射位點(diǎn)等因素也要予以關(guān)注。下文將圍繞用于感染性疾病的疫苗非臨床評價(jià)關(guān)注點(diǎn)進(jìn)行展開。

 

疫苗的形式

 

目前應(yīng)用于非感染性疾病的疫苗多是將整個(gè)病原體滅活或減毒的類型。這類疫苗的免疫反應(yīng)通常比較強(qiáng)，但是也有其缺點(diǎn)，比如產(chǎn)生對非相關(guān)抗原的免疫反應(yīng)、失活疫苗的逆轉(zhuǎn)風(fēng)險(xiǎn)、抗原組分過于復(fù)雜等。此外，全病毒或細(xì)菌疫苗對于產(chǎn)品的純度、工藝放大、批間質(zhì)量一致性也有挑戰(zhàn)。因此，疫苗企業(yè)開發(fā)了亞單位或個(gè)體化疫苗。亞單位疫苗僅包括產(chǎn)生預(yù)期免疫反應(yīng)的抗原，包括蛋白、多糖、多糖偶聯(lián)物、類毒素等，比如乙肝病毒疫苗、白喉疫苗、破傷風(fēng)疫苗、肺炎球菌疫苗等。除了以上，近幾年出現(xiàn)了一些新型疫苗形式如核酸疫苗，包括DNA質(zhì)粒、mRNA或重組病毒載體。其中DNA質(zhì)粒和重組病毒載體的穩(wěn)定性較好，mRNA則會(huì)被體內(nèi)的酶降解，需要用脂質(zhì)納米粒包裹保護(hù)后進(jìn)行遞送。COVID-19的流行為核酸疫苗的快速發(fā)展起到了重要推動(dòng)作用。

 

抗原

 

對于滅活的疫苗，抗原通常由病原體表面的各種蛋白質(zhì)組成。亞單位疫苗的抗原設(shè)計(jì)則要花點(diǎn)心思，需要結(jié)合病原體的生物學(xué)、毒力和傳染性進(jìn)行綜合考量。通常，決定病原體毒力的部分是比較理想的抗原，比如血凝素、刺突蛋白、失活的細(xì)菌毒素。優(yōu)先選擇病原體不同突變株或亞株之間高度保守的序列，確保疫苗能最大范圍覆蓋盡可能多的病原體。當(dāng)然，蛋白苗要注意所選擇的免疫原的獨(dú)特性和唯一性，避免選擇人體中有相似表位的免疫原。另外，蛋白苗要關(guān)注下表達(dá)或合成后是否與病原體表面的天然構(gòu)象具備相同的空間結(jié)構(gòu)，這也是蛋白苗的一個(gè)風(fēng)險(xiǎn)。

 

與蛋白苗不同的是，DNA和mRNA苗遞送到體內(nèi)的是核酸序列。為了保持在血液中的穩(wěn)定性以及方便細(xì)胞攝取，mRNA通常用脂質(zhì)納米粒包裹后遞送。當(dāng)然，mRNA疫苗除了將預(yù)期的RNA序列放入骨架中，也會(huì)加一些非標(biāo)準(zhǔn)核苷，以逃避先天免疫系統(tǒng)的攻擊。DNA疫苗的序列通常嵌入質(zhì)?；蛳俨《局?。mRNA也好，DNA也罷，最終都是將外源性蛋白在宿主細(xì)胞中表達(dá)，并啟動(dòng)人體免疫反應(yīng)。

 

佐劑

 

全病毒或細(xì)菌滅活、減毒疫苗，由于其中既包含預(yù)期免疫原，也包含很多其它微生物成分，在觸發(fā)機(jī)體先天和后天免疫方面要強(qiáng)于亞單位疫苗的。這就要提到佐劑的作用了。佐劑具備增強(qiáng)抗原的免疫反應(yīng)、延長作用時(shí)間、調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)類型、保持抗原在注射位點(diǎn)的緩釋等作用。

 

雖然佐劑本身具備免疫刺激作用，F(xiàn)DA和EMA并不認(rèn)為佐劑屬于制劑處方中的活性成分。原因是已上市的疫苗以鋁鹽佐劑為主，比如氫氧化鋁和磷酸鋁。這類佐劑已經(jīng)使用了幾十年，已有很充分的安全性信息。不過，對于新型佐劑，安全性信息有限，或尚未有上市產(chǎn)品使用過，需要謹(jǐn)慎對待。不同監(jiān)管機(jī)構(gòu)對于新型佐劑的評價(jià)要求不完全一致。EMA要求新型佐劑原則上要在兩個(gè)種屬中（一個(gè)嚙齒類、一個(gè)非嚙齒類）獨(dú)立開展毒理學(xué)研究。WHO則認(rèn)為只需要在一個(gè)毒理研究種屬中，額外設(shè)置一組佐劑對照組即可。

 

疫苗非臨床研究考量因素

 

1、供試品

 

理論上，用于非臨床毒理研究的疫苗、佐劑、含佐劑疫苗的批次應(yīng)該與擬用于臨床試驗(yàn)的一致，且應(yīng)在GMP條件下完成的制備。當(dāng)然，指導(dǎo)原則也留了一定靈活度。如果同批次樣品不易獲得，非臨床研究用樣品應(yīng)該與臨床擬用樣品在生產(chǎn)過程、理化數(shù)據(jù)、制劑和穩(wěn)定性等方面具有可比性。若是二者之間有明顯差異，則需要進(jìn)行詳細(xì)的解釋說明。這點(diǎn)與傳統(tǒng)治療性生物制品要求類似，強(qiáng)調(diào)的還是擬用于毒理研究的樣品與臨床樣品的可比性，并不是嚴(yán)格要求一致。實(shí)操過程中，為了保障藥物開發(fā)進(jìn)度，通常不會(huì)等臨床批次樣品生產(chǎn)且放行完再啟動(dòng)毒理研究，與臨床樣品工藝和規(guī)模類似的工程批往往是首選。但是，對于生殖毒性研究，由于是在臨床階段平行開展的，建議還是使用臨床批次樣品。

 

如果供試品涉及到配制環(huán)節(jié)，如復(fù)融、混合等，需要在給藥前進(jìn)行GLP條件下的供試品分析。但是，由于佐劑的存在，會(huì)吸附抗原，導(dǎo)致抗原濃度的分析有很大挑戰(zhàn)。疫苗開發(fā)企業(yè)最好提供預(yù)混好，不需要進(jìn)一步處理的制劑，可以省去供試品分析環(huán)節(jié)。

 

關(guān)于疫苗的放行，過往大部分藥品監(jiān)管機(jī)構(gòu)要求開展一般毒性/異常毒性等確認(rèn)是否有外源性有毒污染物。不過，美國和歐洲已經(jīng)將這些研究內(nèi)容去掉了，但國內(nèi)、俄羅斯對這些實(shí)驗(yàn)似乎還是有要求。

 

2、種屬選擇

 

疫苗毒理學(xué)研究種屬選擇的核心是動(dòng)物能否對注射的抗原產(chǎn)生免疫反應(yīng)。當(dāng)然，如果所產(chǎn)生的免疫反應(yīng)與人體類似是最理想的。但實(shí)際情況是，動(dòng)物中的免疫反應(yīng)，即使非人靈長類，往往是不能轉(zhuǎn)化到臨床的。WHO強(qiáng)調(diào)，所選擇的動(dòng)物種屬一定要敏感。但無論如何，動(dòng)物所產(chǎn)生的免疫反應(yīng)跟人體還是有很大不同的。落到實(shí)操環(huán)節(jié)，大部分疫苗在毒理研究種屬中會(huì)考察下免疫原性。

 

大鼠和兔子是最常用的疫苗研究用種屬，具備體型小、成本低、免疫反應(yīng)通常還不錯(cuò)的優(yōu)點(diǎn)。其它種屬如小鼠、豚鼠、非人靈長類、犬、小型豬、雪貂等也會(huì)考慮。

 

兔子：兔的免疫反應(yīng)通常很強(qiáng)，是傳統(tǒng)的疫苗毒理學(xué)研究用種屬。兔可以按照人體給藥量（通常0.5mL）實(shí)現(xiàn)單點(diǎn)肌肉注射。此外，兔的血量比較多，可以在同一只動(dòng)物中實(shí)現(xiàn)血液學(xué)、凝血、血生化、免疫學(xué)指標(biāo)檢測。但是，用于檢測兔細(xì)胞免疫反應(yīng)的試劑受限，再就是兔的臨床病理、組織病理學(xué)的歷史背景數(shù)據(jù)也有限。另外，兔被操作時(shí)的心臟相關(guān)指標(biāo)變化特別敏感。兔子膽子非常小，很容易受驚或者被嚇?biāo)溃遣皇蔷褪桥c心臟指標(biāo)過于敏感有關(guān)，最后這句純屬猜測啊。

 

大鼠：相較于兔子，大鼠體型更小，更容易操作，也擁有大量的臨床病理、組織病理學(xué)背景數(shù)據(jù)，且各種免疫檢測試劑也很容易獲得。但臨床常用注射體積（如0.5mL）在大鼠中通常是不能單點(diǎn)注射的，一般要注射兩個(gè)位點(diǎn)。當(dāng)然，可以基于mg/kg進(jìn)行種屬間劑量換算。另外，大鼠血量有限，不能實(shí)現(xiàn)在同一只動(dòng)物同時(shí)考察血液學(xué)、凝血、血生化和免疫學(xué)檢查，會(huì)增加參數(shù)間結(jié)果分析的復(fù)雜性。不過，大鼠在化藥、治療性生物制品等產(chǎn)品毒理研究中是主要嚙齒類種屬。故，很多公司基本也將大鼠作為疫苗毒理研究的主要種屬。

 

小鼠：小鼠在疫苗毒理研究中使用的比家兔或大鼠都要少。不過，很多疫苗的藥理學(xué)或藥效學(xué)研究都是采用小鼠開展的，這其實(shí)就沒有理由拒絕將其作為毒理學(xué)研究種屬。大鼠有的缺點(diǎn)，小鼠基本都是，包括采血量問題、劑量問題等。

 

非人靈長類：非人靈長類的體型允許肌肉注射給予完整的人體劑量，且同一只動(dòng)物血量足夠完成所有計(jì)劃開展的檢測。非人靈長類的肌肉可以實(shí)現(xiàn)一些特殊的給藥裝置如電穿孔給藥。從倫理角度，只有在沒有其他相關(guān)動(dòng)物可用的前提下，才能使用非人靈長類開展毒理研究。疫苗通常是外源性蛋白如來自病毒或細(xì)菌的組分，不存在與食蟹猴中蛋白更相似的情況，這點(diǎn)與傳統(tǒng)治療性生物制品如抗體，還是有很大區(qū)別的。因此，非人靈長類在疫苗毒理研究中用的不太普遍。

 

其它非臨床研究種屬

 

雪貂因?qū)α鞲斜容^敏感，常用于流感疫苗的研究，既作為有效性研究種屬，也作為安全性研究種屬。豚鼠常用于局部耐受性研究或批放行中的異常毒性研究。小型豬的肌肉支持臨床注射劑量，且與人體具備相似的生理學(xué)、皮膚結(jié)構(gòu)和免疫學(xué)特征。但小型豬的免疫學(xué)檢測試劑不易獲取，限制了其使用。犬對吐溫80過于敏感，而吐溫80又是疫苗制劑處方中的常用組分，而且犬的背景數(shù)據(jù)缺乏，免疫學(xué)檢測試劑也受限。

 

3、試驗(yàn)組別設(shè)計(jì)

 

試驗(yàn)組別至少包括生理鹽水對照組（或制劑buffer組）和疫苗組。如果疫苗中含有佐劑，且佐劑未在已上市疫苗中大量使用，則建議加設(shè)佐劑對照組。如果佐劑是諸如磷酸鋁和氫氧化鋁這種已有充分的研究數(shù)據(jù)且已在大量上市產(chǎn)品中使用，則不需要設(shè)置單獨(dú)的佐劑對照組。每組動(dòng)物數(shù)量，WHO也給出了建議，對于大鼠或者小鼠，每組10雌+10雄即滿足要求。嚙齒類動(dòng)物起始年齡在6-8周，兔子年齡在3-4個(gè)月。

 

4、劑量、注射體積及給藥部位

 

疫苗毒理研究理論上允許設(shè)置單個(gè)劑量水平，各個(gè)國家的指導(dǎo)原則均建議采用臨床最大擬用劑量給藥。比如2023年FDA批準(zhǔn)上市的輝瑞的二價(jià)呼吸道合胞病毒（RSV）疫苗ABRYSVO，非臨床一般毒理研究選擇大鼠240μg/天的單劑量設(shè)計(jì)（臨床最大擬用劑量為240μg/天）。不過，2020年FDA批準(zhǔn)上市的Merck的人乳頭瘤病毒（HPV）疫苗GARDASIL 9，非臨床一般毒理研究選擇大鼠低、中、高三劑量的設(shè)計(jì)。

 

給藥途經(jīng)應(yīng)模擬臨床擬用途徑。大部分疫苗臨床使用肌肉注射途徑給藥，也有皮內(nèi)、皮下、鼻腔等給藥途經(jīng)。

 

臨床肌肉注射常用體積為0.5mL，對于兔和體型大的動(dòng)物是沒問題的，通常注射在后肢的股四頭肌。如果需要多次給藥，通常可以左、右側(cè)交替給藥。大鼠常用注射部位是股四頭肌，后肢的其它肌肉如股二頭肌、腓腸肌也可以使用。大鼠和其它嚙齒類動(dòng)物，很難實(shí)現(xiàn)單點(diǎn)肌肉注射臨床擬用體積，畢竟大鼠肌肉最大注射體積不超過0.2mL。小鼠則更受限，每個(gè)肌肉注射位點(diǎn)不超過0.05mL。對于出現(xiàn)無法實(shí)現(xiàn)人體劑量給藥的情況，可以考慮增加抗原濃度，從而減少給藥體積。但是，這種策略并不常見，因?yàn)闈舛鹊母淖儗γ庖叻磻?yīng)也可能有影響。

 

皮下給藥大部分注射部位在肩胛間區(qū)域、頸背側(cè)、肩部或側(cè)面，注射體積可以高達(dá)5mL/kg，也可以按照臨床擬用劑量和體積給藥，倒不會(huì)像肌肉注射那般受限。

 

鼻內(nèi)給藥的疫苗直接將疫苗遞送至鼻腔粘膜。通常適用于流感病毒或呼吸系統(tǒng)相關(guān)病毒。疫苗鼻內(nèi)給藥的主要優(yōu)勢是既能誘導(dǎo)系統(tǒng)免疫，也能誘導(dǎo)局部/粘膜免疫。與其它給藥途經(jīng)相比，會(huì)在局部產(chǎn)生更多的IgA抗體及明顯的細(xì)胞免疫。另外，鼻內(nèi)給藥無創(chuàng)，不需要針頭注射，患者的依從性也會(huì)更好。但是，由于不同種屬鼻腔生理學(xué)差異，大鼠、犬、小鼠并不是合適種屬，非人靈長類如食蟹猴是推薦種屬。

 

5、給藥次數(shù)和給藥間隔

 

給藥次數(shù)至少要覆蓋臨床一年內(nèi)預(yù)期給藥數(shù)量，通常建議N+1次（N為臨床給藥次數(shù)）。

 

動(dòng)物毒理研究中的給藥間隔通常比臨床短，通常2-3周給藥1次。但如果臨床頻率小于2周，臨床前也需要模擬同樣頻率。通常末次藥后2-3天處死主試驗(yàn)組動(dòng)物，2-4周后處理后續(xù)恢復(fù)期動(dòng)物。

 

6、評價(jià)指標(biāo)

 

疫苗的毒理學(xué)評價(jià)指標(biāo)大部分與其它生物制品類似，但也存在需要特別關(guān)注的點(diǎn)，包括局部毒性如注射部位反應(yīng)；免疫反應(yīng)如體溫、急性期反應(yīng)蛋白及抗原特異性免疫反應(yīng)等。

 

局部毒性：建議對疫苗給藥后注射位點(diǎn)進(jìn)行評價(jià)，如紅斑和腫脹，通常通過評分實(shí)現(xiàn)。當(dāng)然，不只疫苗，通常注射劑都會(huì)在重復(fù)給藥毒性試驗(yàn)中伴隨考察局部刺激性，大部分產(chǎn)品沒有刺激性發(fā)生。但疫苗比較特殊，給藥局部有可能會(huì)出現(xiàn)免疫反應(yīng)，所以需要重點(diǎn)關(guān)注。

 

臨床病理：疫苗的臨床病理檢測指標(biāo)與其它藥物的要求大體是類似的，主要包括血液學(xué)、血生化、凝血和尿檢。當(dāng)然，也有一些是疫苗這類產(chǎn)品需要特別關(guān)注的。比如與疫苗免疫反應(yīng)相關(guān)的指標(biāo)如急性期反應(yīng)蛋白，如C反應(yīng)蛋白（CRP）。CRP是人、兔、犬和猴種屬中常用的急性期反應(yīng)指示蛋白，但是，在嚙齒類動(dòng)物中，這一指標(biāo)非常不敏感，反而會(huì)以α1-acid glycoprotein和α2-macroglobulin替代，所以要關(guān)注這些指標(biāo)的種屬間差異。另外，疫苗有引起局部肌肉損傷的風(fēng)險(xiǎn)，可以關(guān)注肌酸激酶的變化。纖維蛋白原也是一個(gè)能反應(yīng)機(jī)體炎癥和急性期反應(yīng)的標(biāo)記物，由于其基線濃度比較高（200-300mg/dL），小幅度的變化通常也是有意義的。另外，佐劑由于也是有免疫活性的，局部注射后引發(fā)的組織損傷及后續(xù)繼發(fā)的臨檢指標(biāo)的變化有時(shí)不好區(qū)分是疫苗中的抗原引起，還是佐劑引起，這也是為什么新型佐劑要加設(shè)佐劑單獨(dú)對照組的原因。

 

免疫學(xué)檢測：免疫學(xué)檢測是疫苗的重中之重。疫苗選擇種屬的很重要的一個(gè)依據(jù)就是該種屬對疫苗中的抗原能產(chǎn)生免疫反應(yīng)，而且最好免疫反應(yīng)的類型和強(qiáng)度與人體可比。根據(jù)所選擇種屬的血容量，能在毒理主研究組采血最佳，實(shí)在血量無法滿足要求，可以考慮設(shè)置衛(wèi)星組。采血點(diǎn)最好覆蓋給藥前、給藥結(jié)束和恢復(fù)期結(jié)束。檢測指標(biāo)涵蓋細(xì)胞免疫和體液免疫。對于亞單位疫苗，如果里面含有多種不同抗原，最好能對每種抗原的免疫反應(yīng)進(jìn)行單獨(dú)檢測。

 

病理學(xué)檢查：疫苗的注射部位反應(yīng)是非常常見的，而且與劑量不是特別相關(guān)，因此需要對注射位點(diǎn)及周圍引流淋巴結(jié)進(jìn)行大體解剖和組織病理學(xué)檢查。其它大多數(shù)組織與常規(guī)毒理學(xué)研究的要求一致，并無太多特殊之處。

 

7、遺傳毒性和致癌性

 

疫苗抗原通常是生物制品，遺傳毒性通常不需要開展。但是，許多新型佐劑組分中可能含有新的化學(xué)成分，則需要對遺傳毒性進(jìn)行考察。疫苗包括佐劑，通常不需要開展致癌性方面的研究。

 

8、組織分布研究

 

對于含有核酸成分的疫苗如DNA疫苗，存在DNA整合至宿主基因組的可能，從而提升癌變、基因組不穩(wěn)定、細(xì)胞異常增殖等風(fēng)險(xiǎn)。佐劑成分中含有寡核苷酸如CpGs，也會(huì)存在類似擔(dān)憂。這類產(chǎn)品通常需要開展生物分布研究，探索疫苗核酸組分分布到哪些組織（如血、心臟、腦、肝臟、腎臟、骨髓、卵巢/睪丸、肺、引流淋巴結(jié)、脾臟、注射部位組織等），監(jiān)測時(shí)間點(diǎn)從幾天到數(shù)月不等。檢測方法需要有足夠的靈敏度、特異性等。RNA疫苗也建議開展。

 

9、神經(jīng)毒性研究

 

許多減毒的病毒疫苗，其活毒是具備潛在的神經(jīng)毒性的。為確保減毒后，這一風(fēng)險(xiǎn)已經(jīng)消失，需要對這類疫苗開展神經(jīng)毒性方面的研究，確定這類疫苗是否在神經(jīng)組織存在和復(fù)制。通常采用猴子開展研究，將病毒疫苗接種到動(dòng)物丘腦或脊髓內(nèi)，之后進(jìn)行17-22天的臨床觀察，動(dòng)物安樂死，在對腦、脊髓組織進(jìn)行病毒特異性的組織病理檢查。如果用小鼠、大鼠進(jìn)行這類試驗(yàn)，最好與監(jiān)管機(jī)構(gòu)先行溝通。

 

10、生殖毒性研究

 

生殖毒性研究的主要目的是評價(jià)疫苗或因疫苗產(chǎn)生的免疫反應(yīng)對胚胎、胎仔是否有影響。關(guān)于疫苗的生殖毒性要求在2006年FDA相關(guān)指南以及ICH S5（R3）中有介紹，感興趣的可以去詳細(xì)了解。如果疫苗有用于育齡婦女、妊娠婦女的可能，則需要在此之前完成發(fā)育和生殖毒性相關(guān)研究。生殖毒性研究所用供試品建議來自臨床擬用批次。所用動(dòng)物種屬類似于常規(guī)毒理研究要求，需要對疫苗中的抗原產(chǎn)生免疫反應(yīng)，嚙齒類和兔用的最多。通常僅選擇一個(gè)種屬進(jìn)行考察即可。劑量方面的考量也類似重復(fù)給藥毒性研究，一般采用代表臨床劑量的單劑量即可。一般選擇在動(dòng)物交配前即開始給藥，給藥貫穿整個(gè)妊娠周期，甚至有企業(yè)在動(dòng)物哺乳期還在給藥，以確保動(dòng)物體內(nèi)產(chǎn)生足夠的抗體滴度和充分的毒性暴露。