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細胞毒性檢測法（Calcein-AM/PI雙染法）是一種常用的細胞活力和毒性評估方法。其原理基于細胞膜的完整性和代謝活性兩個關(guān)鍵指標。在實驗中，通過使用兩種熒光染料Calcein-AM和PI（Propidium Iodide），可以快速準確地評估細胞的狀態(tài)。

Calcein-AM是一種脂溶性的非熒光染料，可以穿過完整的細胞膜進入細胞內(nèi)部。在細胞內(nèi)，Calcein-AM會被細胞內(nèi)的酯酶水解成為高度熒光的Calcein。只有活著的細胞才能將Calcein-AM水解成Calcein，因此高熒光信號表明細胞的代謝活性和細胞膜完整性良好。而PI是一種核酸染料，只有在細胞膜受損時才能進入細胞內(nèi)結(jié)合DNA并發(fā)出紅色熒光。因此，當細胞膜受損時，PI會進入細胞并與DNA結(jié)合，發(fā)出紅色熒光信號。

通過同時觀察Calcein的綠色熒光和PI的紅色熒光，可以區(qū)分出三種細胞狀態(tài)：活著的細胞（只有綠色熒光），死亡的細胞（只有紅色熒光），以及受損但仍存活的細胞（同時有綠色和紅色熒光）。根據(jù)熒光信號的強弱和分布，可以定量和分析不同條件下細胞的存活率和毒性程度，從而評估藥物的毒性、細胞培養(yǎng)的質(zhì)量以及其他相關(guān)的生物學(xué)研究問題。

一、實驗步驟

1、制備工作液

1）首先，將保存在低溫環(huán)境中的Calcein-AM溶液（2 mM）和PI溶液（2 mM）擱置至室溫。

2）隨后，取出5µl Calcein-AM溶液（2 mM）和12.5µl PI溶液（2 mM），并加入到含有5ml pH值為7.4的1倍PBS緩沖液中。將混合液徹底混勻。這一步驟完成后，得到的工作液中，Calcein-AM的濃度為2µM，而PI的濃度為5µM。

2、染色

1）首先，使用胰酶-EDTA對細胞進行消化，然后以1000 rpm的速度進行離心5分鐘，收集細胞。

2）棄上清，并使用pH值為7.4的1xPBS緩沖液洗滌細胞2~3次，以消除殘留的酯酶活性。

3）對細胞進行計數(shù)，并調(diào)整細胞懸液的濃度至1×10^5~1×10^6細胞/ml。

4）取100µl染色工作液加入200µl細胞懸液中，混勻后在37℃下孵育15-30分鐘。

5）使用490±10 nm的激發(fā)濾片在熒光顯微鏡下同時檢測活細胞（黃綠色熒光）和死細胞（紅色熒光）。此外，使用545 nm的發(fā)射濾片僅可觀察到死細胞。也可直接在熒光酶標儀下使用適當?shù)臑V片進行檢測。

二、注意事項

1、鑒于不同細胞系對最佳染色條件的需求有所差異，建議在初次實驗時進行梯度實驗，以確定Calcein-AM和PI的最佳濃度。

2、由于培養(yǎng)基中的成分如血清含有酯酶，Calcein-AM在遇水時會分解，導(dǎo)致背景信號上升。因此，需要多次離心，并使用PBS緩沖液反復(fù)洗滌，直到細胞完全洗凈。

3、在進行碘化丙啶（PI）操作時務(wù)必注意防護措施。如果碰到皮膚，應(yīng)立即用自來水進行沖洗。

4、初次使用Calcein-AM溶液和PI溶液時，建議對原液進行分裝，以降低反復(fù)凍融的頻率。

5、由于 Calcein-AM 的穩(wěn)定性較差，所以此染色工作液必須現(xiàn)配現(xiàn)用，以免影響實驗的進行。

如圖為Calcein-AM/PI雙染法細胞存活測定，活細胞（綠色熒光）和死細胞（紅色熒光）