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本文使用一組已通過生物等效性正式試驗的高變異藥物研究數(shù)據(jù)，進(jìn)行上百次模擬生物等效性預(yù)試驗，統(tǒng)計主要藥代動力學(xué)參數(shù)（Cmax、AUC）的幾何平均值和個體內(nèi)變異系數(shù)的概率，據(jù)此推測高變異藥物生物等效性預(yù)試驗通過的概率。結(jié)果顯示，主要藥代動力學(xué)參數(shù)的幾何均值具有較大的隨機(jī)性和不確定性，個體內(nèi)變異系數(shù)受個體受試者數(shù)據(jù)影響較大。采用兩周期交叉試驗設(shè)計開展生物等效性預(yù)試驗不能有效地指導(dǎo)高變異藥物制劑處方工藝開發(fā)及生物等效性正式試驗。

 

隨著仿制藥質(zhì)量和療效一致性評價工作的深入開展，藥物研發(fā)機(jī)構(gòu)一般會選擇采用兩周期交叉試驗設(shè)計開展生物等效性預(yù)試驗研究，為制劑處方工藝開發(fā)及正式生物等效性試驗提供數(shù)據(jù)支持。對于 BCS1 類或 3 類藥物，開展生物等效性預(yù)試驗，一定程度上加快了藥物研發(fā)進(jìn)程。而對于高變異藥物（指某些藥物由于生物利用度過低、酸不穩(wěn)定、吸收前的廣泛代謝等原因，導(dǎo)致一個或多個藥動學(xué)參數(shù)的個體內(nèi)變異系數(shù)（Within-subject Coefficient of Variation,CVW%）大于或等于 30%。采用兩周期交叉試驗設(shè)計法獲得的生物等效性預(yù)試驗數(shù)據(jù)是否能夠有效指導(dǎo)制劑處方工藝開發(fā)及正式生物等效性試驗，業(yè)內(nèi)存在較大爭議，主要觀點如下：

 

（1）為生物等效性試驗樣本量估算提供依據(jù)：國家藥品監(jiān)督管理局（NMPA）、美國食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）[1] 相關(guān)指導(dǎo)原則均建議正式試驗開始之前，可在少數(shù)志愿者中進(jìn)行預(yù)試驗。預(yù)試驗可用于驗證分析方法、評價變異情況、優(yōu)化采樣時間，并獲得其他相關(guān)信息。用于評價變異情況的藥代動力學(xué)參數(shù)（藥峰濃度 Cmax 和藥物曲線面積 AUC）幾何均值比以及個體內(nèi)變異系數(shù)（CVW%）等，并據(jù)此進(jìn)行研究方案設(shè)計，計算合適的受試者例數(shù)。

 

（2）為制劑處方工藝開發(fā)參考依據(jù)：如沒有建立體內(nèi)外相關(guān)性較強的溶出曲線評價方法的話，可采用生物等效性預(yù)試驗評估仿制制劑與參比制劑處方工藝的差異，主要藥代動力學(xué)參數(shù)（Cmax 和 AUC）幾何均值比以及個體內(nèi)變異系數(shù)（CVW%）如與參比制劑有明顯差異，為制劑處方工藝優(yōu)化調(diào)整提供方向[2]。

 

（3）完全沒有必要開展生物等效性預(yù)試驗：對于高變異藥物，如采用常規(guī)的受試者例數(shù)（一般為 12 例），個別樣本變異較大，會影響生物等效試驗參數(shù)的計算結(jié)果，有時即使參比制劑與自身相比較，也可能出現(xiàn)不能證明其生物等效的情況[3]，生物等效性預(yù)試驗結(jié)果會出現(xiàn)假陽性或假陰性數(shù)據(jù)。

 

高變異藥物生物等效試驗的樣本量對于藥物的生物等效試驗非常重要，由于藥物在個體內(nèi)的變異大，數(shù)據(jù)的離散程度也就比較大，使用常規(guī)樣本來進(jìn)行生物等效試驗很可能會把生物等效的藥物誤判為不等效的藥物，樣本量過大又涉及到成本和倫理方面的問題，因此對高變異藥物的生物等效的樣本估算是非常重要的，高變異藥物生物等效試驗樣本量估算產(chǎn)生最大影響的主要是參比制劑的 CV 值和受試制劑與參比制劑之間的幾何均值比。

 

我們參考 Isabel Moreno 等人證明最有效的 12 個受試者單次給藥雙交叉的模擬預(yù)試驗設(shè)計，按照預(yù)試驗的結(jié)果來分別計算對正式試驗入組例數(shù)估算最重要的兩個因素變異系數(shù) CV 值和幾何均值[4]。尤其通過調(diào)查是同一個參比制劑在預(yù)試驗中的 CV 值和幾何均值的分布范圍，進(jìn)而了解如果參比制劑和受試制劑如果在藥學(xué)上非常接近，預(yù)試驗是否能很好地預(yù)測正式試驗的結(jié)果和正式試驗需要的受試者例數(shù)。同時，也考察對于AUC的變異也超出30%的情形下，預(yù)試驗是否能夠很好地預(yù)測 AUC 的比值。

 

有很多專家學(xué)者認(rèn)為預(yù)試驗結(jié)果中，數(shù)據(jù)的“單向偏移”（大多數(shù)受試者的兩次暴露量的比值均大于或小于 1）可以用來定性的預(yù)測受試制劑和參比制劑的暴露量的關(guān)系，并應(yīng)用這個結(jié)果來決定是否開展正式生物等效試驗或者用來指導(dǎo)制劑的進(jìn)一步開發(fā)。我們對這樣的一個假設(shè)表示懷疑，我們也利用這些數(shù)據(jù)來模擬計算這樣的假設(shè)是否正確。

 

1、試驗方法

 

生物等效性試驗數(shù)據(jù)：某高變異藥物隨機(jī)、開放、三周期、部分重復(fù)健康成人生物等效性試驗數(shù)據(jù)，受試者例數(shù)42 例。

 

模擬試驗：采用 DAS 2.0 軟件對生物等效性數(shù)據(jù)進(jìn)行計算藥代動力學(xué)參數(shù)，并進(jìn)行等效性評價。參考 IsabelMoreno 等人過去采用的方法[4]，在一個已經(jīng)通過生物等效的高變異藥物的試驗數(shù)據(jù)中，按照 2×12 的取樣方法來進(jìn)行模擬的預(yù)試驗，采用 Excel 軟件中的函數(shù)取隨機(jī)號，分別抽取 100 次，每次都計算每一次模擬預(yù)試驗取得數(shù)據(jù)的幾何均值和 CV 值。然后對這 100 次結(jié)果的幾何均值和 CV 值的分布進(jìn)行統(tǒng)計。

 

2、試驗結(jié)果

 

2.1 用于生物等效性試驗樣本量估計的風(fēng)險分析

 

采用兩周期交叉試驗設(shè)計法對同一批參比制劑進(jìn)行生物等效性試驗研究，在 N=42 的條件下，主要藥代動力學(xué)參數(shù) Cmax、AUC（0-t）、AUC（0- ∞）幾何均值比值的 90% 置信區(qū)間數(shù)值符合要求；按照隨機(jī)號順序分為 2 組，即N=21 的條件下，出現(xiàn)了第一組（1 ～ 21號）等效，第二組（22 ～ 42）不等效的情形；按照隨機(jī)號順序分為 2 組，即N=14 的條件下，三組結(jié)果均不等效。因此，采用兩周期交叉試驗進(jìn)行生物等效性預(yù)試驗研究獲得體內(nèi)變異系數(shù)進(jìn)行正式生物等效性樣本量估計以及臨床研究方案設(shè)計，存在較大的風(fēng)險。

 

表1 不同樣本量條件下參比制劑藥代動力學(xué)參數(shù)體內(nèi)變異系數(shù)及90%置信區(qū)間統(tǒng)計結(jié)果

 

在采用 2×12 的模擬預(yù)試驗的方式進(jìn)行模擬計算的結(jié)果顯示同一個參比制劑其 CVW 值分別在 22.7% ～ 49.7%（R1，Cmax）、17.7% ～ 64.8%(R2，Cmax) 和 17.6% ～ 51.4%（R1，AUC）、19.1% ～ 58.3%（R2，AUC）這樣一個比較寬泛的內(nèi)波動，統(tǒng)計這些數(shù)字在不同區(qū)間內(nèi)出現(xiàn)的頻次見圖 1。從圖可見，CVW 值在 26% ～ 50% 之間的分布相對而言在各個區(qū)間沒有太明顯的區(qū)別，同一個參比制劑分別按照 R1 和 R2 來進(jìn)行統(tǒng)計的的結(jié)果還是有一定的差異的，這充分的說明了預(yù)試驗所取得的CVW 值除了在個別的區(qū)間內(nèi)出現(xiàn)的幾率略高一些外，在很寬的一個范圍內(nèi)出現(xiàn)的幾率相差并不大。并且，模擬預(yù)試驗的計算結(jié)果中出現(xiàn)了相當(dāng)一部分（最少的有 14 次）的 CVW 值是小于 30%的這樣的結(jié)果，這進(jìn)一步提示了我們預(yù)試驗的結(jié)果很難用于對正式試驗的CVW 值的預(yù)測，因此，用這樣的結(jié)果來預(yù)測正式試驗的例數(shù)是不可靠的。

 

圖1 參比制劑主要藥代動力學(xué)參數(shù)個體內(nèi)變異系數(shù)概率分布圖

 

在統(tǒng)計 100 次模擬預(yù)試驗所取得的 Cmax 和 AUC 的幾何均值的結(jié)果見圖 2、圖 3、圖 4。從圖可見，對于同一參比制劑的 2 次給藥的模擬計算結(jié)果而言，無論是 Cmax 還是 AUC 的比值，都分布在一個比較寬的范圍之內(nèi)，因而，Cmax 和 AUC 即使對于同一個藥物而言，它的幾何均值比在一個比較寬的范圍內(nèi)普遍分布，單次的預(yù)試驗取得的 GMR 的數(shù)值的隨機(jī)性是比較大的，用來計算正式試驗需要的試驗例數(shù)自然也會有很大的隨機(jī)性。值得注意的是，這些均值比絕大多數(shù)情形下都分布在 0.80 ～ 1.25 之間，這從某個層面也可能證實了采用生物等效標(biāo)準(zhǔn)的范圍為80% ～ 125% 是合理的。

 

圖2 參比制劑藥代動力學(xué)參數(shù)（Cmax、AUC）幾何平均值概率分布圖

 

圖3 參比制劑/受試制劑藥代動力學(xué)參數(shù)（Cmax）幾何平均值概率分布圖

 

圖4 參比制劑/受試制劑藥代動力學(xué)參數(shù)（AUC）幾何平均值概率分布圖

從統(tǒng)計兩次參比制劑和受試制劑的藥代數(shù)據(jù)的幾何均值的結(jié)果中可見，無論是用哪一次參比制劑數(shù)據(jù)來進(jìn)行處理，幾何均值比都是隨機(jī)出現(xiàn)在 0.86 ～ 1.25 之間非常寬的一個范圍之內(nèi)，并且會有相當(dāng)一部分結(jié)果超出了1.25 的范圍。因此，單個預(yù)試驗的幾何均值比的結(jié)果實際上還是在比較大范圍內(nèi)的一個隨機(jī)數(shù)，因此用這個數(shù)值來計算受試?yán)龜?shù)，會有很大的風(fēng)險。

 

2.2 用于制劑處方工藝開發(fā)的風(fēng)險分析

 

有很多專家學(xué)者認(rèn)為可以從 BE 預(yù)試驗的結(jié)果中來定性判斷受試制劑和參比制劑相比的暴露量的相對大小，即預(yù)試驗的幾何均值如果大多數(shù)情形下 T/R大于 1，或者小于 1 即說明數(shù)據(jù)有單邊偏向，認(rèn)為受試制劑的暴露量比參比制劑大或者小，并以此為依據(jù)進(jìn)一步進(jìn)行制劑的處方和工藝的優(yōu)化工作。

 

但是我們從以上的幾個圖表中可以明顯地看到這些幾何均值的分布在一定范圍內(nèi)的分布是隨機(jī)的。因此，預(yù)試驗并不能真正體現(xiàn)受試制劑和參比制劑藥物暴露量的相對大小。為了更加準(zhǔn)確地說明這個問題，排除由于單個受試者過高或過低的血藥濃度的試驗數(shù)據(jù)帶來誤差的影響，我們分別統(tǒng)計了每一例受試者的受試制劑和參比制劑的 Cmax和 AUC 的幾何均值的比值的大小，對于在正式的試驗中 Cmax 的幾何均值比 T/R1、T/R2 分別有 24 個受試者和19 個受試者是大于 1，而 AUC 的幾何均值比 T/R1、T/R2 中則分別有 21 例和 15 例受試者大于 1，說明除了 T/R2的 AUC 的比值相對而言有一定的偏向，而其他的數(shù)據(jù)沒有單邊偏向。我們進(jìn)一步統(tǒng)計每一次預(yù)試驗的結(jié)果，統(tǒng)計每一次受試制劑和參比制劑的比值大于 1 或者小于 1 的情形，結(jié)果見圖 5 和圖 6，從圖可見每一次模擬預(yù)試驗抽取的樣本中，出現(xiàn)受試者使用參比制劑和受試制劑都會出現(xiàn)比較多的“單邊”的現(xiàn)象，100 次中，12 例出現(xiàn)僅出現(xiàn) 3 例受試制劑暴露量超過參比制劑的幾率和出現(xiàn) 9例受試制劑暴露量都超過參比制劑的幾率相差不大。因此，雖然從總體上來看有一定的集中度，但是單次預(yù)試驗的結(jié)果的隨機(jī)性還是比較大，從預(yù)試驗中取得的 T/R>1 的數(shù)據(jù)來分析受試制劑和參比制劑的暴露量的關(guān)系也是有很大的風(fēng)險的，用這樣的結(jié)果來指導(dǎo)制劑處方工藝開發(fā)存在較大風(fēng)險。

 

圖5 參比制劑/受試制劑藥代動力學(xué)參數(shù)（AUC）幾何均值概率分布圖

 

圖6 參比制劑/受試制劑藥代動力學(xué)參數(shù)（Cmax）幾何均值概率分布圖

 

在實際操作過程中，我們不可能去做多次的預(yù)試驗來預(yù)測正式試驗的結(jié)果以及相關(guān)的試驗設(shè)計，通過模擬計算發(fā)現(xiàn)單次的試驗的 Cmax、AUC 的幾何均值和 CV 值的在一個比較大的范圍內(nèi)是隨機(jī)出現(xiàn)的。而且，通過模擬計算也表明所謂的數(shù)據(jù)“單向偏移”存在著同樣的概率出現(xiàn)，預(yù)試驗的結(jié)果也不能給出一個定性的受試制劑和參比制劑暴露量之間的關(guān)系的方向。

 

3、討 論

 

由于高變異藥物受個體內(nèi)變異影響較大，通過兩周期交叉試驗設(shè)計法生物等效性預(yù)試驗對正式試驗樣本量估計以及指導(dǎo)制劑處方工藝開發(fā)，存在較大風(fēng)險，因此不建議采用兩周期交叉試驗設(shè)計對高變異藥物進(jìn)行生物等效性預(yù)試驗研究。

 

由于仿制藥與參比制劑處方工藝存在一定差異，文獻(xiàn)報道數(shù)據(jù)僅供參考，在制劑處方工藝開發(fā)階段及正式生物等效試驗開展前，藥物研發(fā)機(jī)構(gòu)最好開展預(yù)試驗研究，以降低研究成本及正式生物等效性的風(fēng)險。在如何高效地進(jìn)行高變異藥物的生物等效預(yù)試驗的研究過程中，可采用重復(fù)試驗設(shè)計法（部分重復(fù)或完全重復(fù)）或兩階段設(shè)計法。

 

國家藥品監(jiān)督管理局發(fā)布的《高變異藥物生物等效性研究技術(shù)指導(dǎo)原則》[1]，為以藥動學(xué)參數(shù)為主要終點指標(biāo)的高變異化學(xué)藥物開展生物等效性試驗研究設(shè)計、樣本量估算、統(tǒng)計分析、結(jié)果報告等方面提供了技術(shù)指導(dǎo)，建議采用重復(fù)試驗設(shè)計（部分重復(fù)或完全重復(fù)）進(jìn)行生物等效試驗預(yù)試驗，獲得必要的藥代動力學(xué)參數(shù)，為正式生物等效試驗提供數(shù)據(jù)支持，設(shè)計合理的臨床研究方案，并確定合理的樣本量。

 

近年來，兩階段設(shè)計（Two-StageDesign，TSD）生物等效性研究由于其在樣本量估算方面的適應(yīng)性、靈活性，已被各國指南所認(rèn)可（FDA、EMA、加拿大、澳大利亞、日本、新西蘭、WHO 等）[6]。雖然在《中國藥典》9011 藥物制劑人體生物利用度和生物等效性試驗指導(dǎo)原則中明確指出：“在證明生物等效性時，可以接受兩階段試驗方法，最初一組受試者給藥并分析數(shù)據(jù)，如果不能證明生物等效，則可以增加招募一組受試者，在最終分析中合并兩組的結(jié)果”，制藥企業(yè)及藥物研究單位可在生物等效預(yù)試驗研究中參考使用。

 

參考文獻(xiàn)

 

[1] 美國食品藥品監(jiān)督管理局，2013，以藥代動力學(xué)為終點評價指標(biāo)的簡化新藥申請的生物等效性研究的指導(dǎo)原則.

[2] 于永沛，閆小妍，姚晨等. 高變異藥生物等效性研究中的樣本量估計 [J]. 中國新 藥雜志，2018,27(9):1019-1024.

[3] 國家藥品監(jiān)督管理局，2018，高變異藥物生物等效性研究技術(shù)指導(dǎo)原則.

[4] Isabel Moreno1,Dolores Ochoa,Manuel Roman, et al. Utility of PilotStudies for Predicting Ratios andIntra-subject Variability in HighVariability Drug[J].Basic & ClinicalPharmacology & Toxicology,2016.

[5] 劉甜甜，陸夢潔，周潼潼等，高變異藥物生物等效性評價確切樣本量計算 [J]. 中國臨床藥理學(xué)雜志，2017, 33(6):1152-1156.

[6] 孫華，謝大虎，梁海棠，兩階段生物等效性研究的試驗設(shè)計及關(guān)注要點 [J]. 藥物評價研究，2017,40(5):593-599.

 

本文作者劉清梁1,3、王文峰2、鄒江1、楊琰1、張吉喜3*，1華潤雙鶴藥業(yè)股份有限公司、2華潤醫(yī)藥集團(tuán)、3重慶大學(xué)生物工程學(xué)院，僅供交流學(xué)習(xí)。