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實時熒光定量PCR（簡稱RT-qPCR），通常將提取細胞或者組織的總RNA逆轉錄成cDNA。之后以cDNA為模板，以dNTP 為底物，對擴增出的DNA進行定量分析。

 

在這里以下是對miR-A的qPCR數(shù)據(jù)（來自Bio-Rad儀器）進行統(tǒng)計分析的詳細步驟：

 

（1）以miR-A為目的基因，內參為U6：檢測相對于對照組，實驗組miR-A的相對mRNA表達水平，以下為Bio-Rad儀器導出的數(shù)據(jù)：

 

圖1原始數(shù)據(jù)

 

（2）拿到原始數(shù)據(jù)我們一般只需看圖1中標紅的①②③列數(shù)據(jù)，并將數(shù)據(jù)復制粘貼值新的工作表中，對數(shù)據(jù)進一步處理。對目的基因進行相對定量分析，則使用ΔΔCt法，Bio-Rad儀器中的Cq即為基因的“CT值”，計算公式如下：

 

實驗組目標基因相對于對照組的相對表達量=2-ΔΔCt

 

1）A:計算Ct值：分別測定目的基因和內參基因在實驗組和對照組中的Ct值，即原始數(shù)據(jù)中的Cq值。

 

B:計算ΔCt值：對于每個樣本，計算目的基因與內參基因的Ct值之差（ΔCt = Ct目的基因-Ct內參基因）。

 

C:計算ΔΔCt值：實驗組ΔCt值與對照組ΔCt值之差（ΔΔCt = ΔCt實驗組 - ΔCt對照組）。

 

（3）計算原始數(shù)據(jù)，我們在新的Excel工作表中制作以下表頭：

 

圖2 表頭以及數(shù)據(jù)統(tǒng)計

 

（4）具體計算步驟：

 

1）用【average】函數(shù)分別求出對照組和實驗組中U6內參Cq值的平均值 ；

 

圖3 內參Cq值的平均值

 

注意：目的基因的Cq值減去內參基因的Cq值的平均值，是用于歸一化目的基因和內參基因的反應量，從而消除實驗操作和RNA提取效率等因素的影響，得到更準確的相對定量結果。

 

2）隨后，再用①對照組和實驗組目的基因的各個Cq分別減去②內參Cq值的均值即為③ΔCq；之后求出④對照組（目的基因Cq-內參Cq均值）的均值；

 

圖4 實驗組ΔCq

 

圖5 對照組ΔCq

 

圖6 對照組（目的基因Cq-內參Cq均值）的均值

 

3）③目的基因的各組ΔCq值再減去④對照組（目的基因Cq-內參Cq均值）的均值即為⑤ΔΔCq，最后用【Power】函數(shù)計算2-ΔΔCq值，：

 

圖7 ΔΔCq計算

 

4)最后用⑥【Power】函數(shù)計算2-ΔΔCq值，excel選擇下拉得到所有值，具體計算如下：如圖3：

 

圖8 【Power】函數(shù)計算2-ΔΔCq值

 

5)整體計算數(shù)據(jù)如下，我們最后求出三次技術重復的平均值⑦，即為我們一次生物學重復的值:

 

圖 9 整體數(shù)據(jù)計算

 

（5）因此，步驟（4）中計算得出了一組數(shù)據(jù)即為一次生物學重復，將對照組的目的基因表達標準化。相對于對照組，實驗組的miR-A的相對表達量降低了；但實際上我們需要三次生物學重復才能得到這樣的結論。

 

注意 ：技術重復是指相同的樣品同時做3-4個平行，用于消除人為的系統(tǒng)誤差，篩選測出比較準確的值；而生物學重復是指我們需要消除樣品的差異，避免結論的偶然性，即不能用一次生物學重復便得出結論。例如一些臨床樣本可能就需要一般患者和健康者的樣本數(shù)要n>15。圖3中Test/Normal的3個數(shù)據(jù)分別為一次技術重復，一組為一次生物學重復。

 

（6）統(tǒng)計分析：使用適當?shù)慕y(tǒng)計檢驗方法（如T檢驗、ANOVA等）來評估不同組之間基因表達差異的顯著性。圖中我們以三個技術重復為例用graphpad prism作為分析miR-A的相對表達量。結果用Graphpad軟件作圖如下：

 

圖 10 miR-A的相對mRNA表達水平

 

注意事項：

 

（1）對于原始數(shù)據(jù)，我們要去除潛在的干擾物質、識別和處理異常值（如由于實驗誤差或儀器故障導致的極端值）。

 

（2）確保每個樣本至少有三次生物學重復，以提高數(shù)據(jù)的可靠性。

 

（3）得到數(shù)據(jù)后，我們可以在Bio-RadPCR儀上查看數(shù)據(jù)的有效性，例如查看數(shù)據(jù)溶解曲線是否為雙峰，引物特異性是否有問題；查看擴增曲線、擴增效率是否正常等。

 

（4）另外還需要注意的是一組數(shù)據(jù)之間正常的數(shù)據(jù)重復需要可靠，因此一個基因的實驗組或者對照組我們通常會設置3-4個復孔減少加樣誤差，通常的技術重復孔之間數(shù)據(jù)相差±0.5個Cq值均不能使用。