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免疫組化（IHC）作為一種重要的實驗技術(shù)，被廣泛應(yīng)用于病理學研究中。然而，實驗過程中常會遇到各種問題，如假陽性、假陰性等問題，嚴重影響實驗結(jié)果的準確性和可靠性。本文將結(jié)合實際操作經(jīng)驗，詳細分析并總結(jié)免疫組化實驗中可能存在的問題及解決方法，幫助大家提高實驗成功率。

 

一、假陽性或背景高的處理

 

1. 降低一抗?jié)舛?/span>

 

降低一抗的濃度至既能看到陽性表達又能明顯區(qū)分陽性區(qū)域與周圍間質(zhì)時為止。如無法達到此效果，建議更換一抗。

 

2. 調(diào)整封閉條件

 

逐步提高封閉條件，從山羊血清到5%BSA+山羊血清，最終至5%脫脂奶。然而，通常調(diào)整至5%BSA+山羊血清即可，不建議輕易使用5%脫脂奶。

 

3. 二抗選擇

 

對于動物標本，選擇抗鼠或抗兔的二抗，避免使用通用型二抗，以免種屬間抗原抗體反應(yīng)引起假陽性。

 

二、假陰性的處理

 

1. 抗原修復

 

確保使用正確的抗原修復方法，必要時查閱相關(guān)文獻。

 

2. 系統(tǒng)檢查

 

使用任何腫瘤類型的切片進行Ki-67染色，以判斷體系及二抗是否存在問題。若Ki-67染色陰性，需檢查以下步驟：

 

二甲苯酒精是否需要更換

 

PBS緩沖液的pH值是否正常

 

抗原修復液的使用及修復時間是否正確

 

3. 標本保存

 

避免使用保存時間過久的標本。石蠟切片應(yīng)盡量放置于-20°C避光保存，標本保存超過三年往往影響染色效果。

 

三、設(shè)置對照

 

1. 自身對照

 

同一張組織切片中，癌和癌旁表達不同的區(qū)域可作為自身對照，以確認抗體表達的陽性或陰性為真。

 

2. 陽性對照

 

當陽性率過低或無陽性表達時，需做陽性對照，以確認標本陰性為真陰性。

 

3. 陰性對照

 

當標本染色陽性率過高時，需做陰性對照，以確認陽性表達并非由非特異性染色引起。

 

四、陽性對照的制備與選擇

 

1. 購置陽性對照

 

可從公司購置陽性對照片。

 

2. 選擇合適的陽性對照

 

根據(jù)抗體說明書選擇相應(yīng)的陽性組織，如PD-L1選用人胎盤作為陽標。

 

3. 試染不同病例

 

根據(jù)文獻選擇表達率最高的病種，選擇5例不同的病例進行試染。

 

五、實驗中的注意事項

 

1. 抗原修復

 

微波修復需間隔進行，防止抗原修復液蒸發(fā)引起干片。

 

高壓鍋內(nèi)需放置足量的抗原修復液，避免使用蒸餾水或自來水。

 

2. 一抗的配制

 

盡量使用抗體稀釋液配制一抗工作液，存儲不得超過一周，避免使用封閉液或BSA作為抗體稀釋液，以防影響一抗效價。

 

3. DAB顯色問題

 

DAB需現(xiàn)用現(xiàn)配，若非馬上使用可暫時避光保存。

 

顯色時需及時觀察切片上色情況，區(qū)域性黃染出現(xiàn)時即可終止顯色。

 

DAB顯色時間較短，一般數(shù)秒至1-2分鐘，超過5分鐘不上色需立即停止顯色。

 

4. 蘇木素復染問題

 

復染前需經(jīng)蒸餾水清洗以保護蘇木素。

 

根據(jù)所用蘇木素類型選擇適當?shù)姆稚椒?，避免用錯分色液。

 

5. AEC顯色問題

 

AEC顯色用于某些特殊腫瘤，如惡性黑色素瘤，顯色時間較長，需20-30分鐘。

 

6. 蓋玻片處理

 

蓋玻片使用前需過酸處理，時間為數(shù)秒，然后置于流水中沖洗干凈。

 

7. 脫水封片

 

免疫組化染色結(jié)束后的切片脫水時間不需很久，每個缸數(shù)秒即可。

 

六、其他實驗細節(jié)

 

1. 實驗數(shù)量

 

一次實驗切片數(shù)量不宜過多，特別是初學者，以免時間差距導致結(jié)果不穩(wěn)定。

 

2. 避免干片

 

實驗過程中避免干片，特別是初學者，寧可浪費一些試劑也不能出現(xiàn)干片情況。

 

3. 記錄與觀察

 

首次實驗必須做完整的實驗記錄，以便查找失敗原因，觀察時需先低倍后高倍，避免誤判。

 

4. 貼簽標明

 

注意貼簽，標明標本號、抗體名稱、稀釋倍數(shù)及日期，以便出現(xiàn)問題時查找原因。

 

通過以上總結(jié)，相信大家可以更好地應(yīng)對免疫組化實驗中的各種問題，提高實驗成功率。希望本文能為各位讀者提供有價值的參考，助力科學研究順利進行。