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動(dòng)物組織蛋白的提取即通過物理研磨和破碎組織的方法，以及化學(xué)手段增加細(xì)胞膜通透性、破壞細(xì)胞膜和破壞蛋白質(zhì)間相互作用，從而提取細(xì)胞中的可溶性蛋白質(zhì)。

組織蛋白提取步驟：

1、準(zhǔn)備好所需數(shù)量的離心管，并在每個(gè)管中放入研磨珠，將它們置于冰盒上備用。

2、從-80℃冰箱取出所需的動(dòng)物組織，將其置于冰上解凍。在此過程中，準(zhǔn)備EP管，并依次進(jìn)行稱量、校零、加入組織、再次稱量，并記錄每個(gè)管中組織的重量。

3、對(duì)組織塊進(jìn)行預(yù)冷 PBS 洗滌 2-3 次，以除去血污，然后將其放在濾紙上，吸除多余的 PBS 后放入對(duì)應(yīng)的勻漿管中。

4、加入大約10倍樣本體積的 RIPA 裂解液（按需加蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑）。將管置于組織研磨儀中，對(duì)稱放置后蓋上蓋子，選擇程序開始勻漿。

5、勻漿完成后，將勻漿管置于冰上靜置30分鐘，以充分裂解組織（或使用超聲波處理10分鐘）。

6、使用離心機(jī)在12000rpm、4℃下離心10分鐘。

7、取上清液，避開上層油脂和底層雜質(zhì)（上清液立刻轉(zhuǎn)移入新的離心管中保存待用）。

8、使BCA方法檢測(cè)蛋白濃度，步驟與提取全蛋白相同。

9、將提取的蛋白加入5×loading緩沖液，然后在95攝氏度下煮沸10分鐘，并將煮好的蛋白放入-80℃冰箱保存。

注意事項(xiàng)：

1、組織提取全程必須在冰上進(jìn)行，以確保蛋白質(zhì)不易降解。任何環(huán)節(jié)中，如果溫度過高，都可能導(dǎo)致蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)破壞和活性喪失。

2、在進(jìn)行組織量的稱量時(shí)，最好確保各個(gè)樣本的重量一致，以保證后續(xù)測(cè)量蛋白濃度的準(zhǔn)確性。

3、組織提取蛋白后，離心后管底通常會(huì)有較多沉淀物。在吸取上清液時(shí)，務(wù)必避免誤將管底內(nèi)的沉淀物一并吸取，以免影響蛋白質(zhì)的純度和后續(xù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

4、對(duì)于芝麻大小的組織，通常添加100-200μL完全裂解液進(jìn)行提??；綠豆大小的組織，則需要加入400-600μL完全裂解液；而對(duì)于黃豆大小的組織，建議添加800-1000μL完全裂解液以確保充分裂解。

5、為了防止提取的蛋白質(zhì)降解，通常在細(xì)胞裂解試劑中添加蛋白酶和磷酸酶抑制劑。蛋白酶抑制劑可以防止蛋白質(zhì)在裂解過程中被內(nèi)源性蛋白酶降解，而磷酸酶抑制劑則可阻止細(xì)胞內(nèi)磷酸化相關(guān)的信號(hào)傳導(dǎo)通路，從而保護(hù)蛋白質(zhì)的完整性和功能。

6、組織蛋白提取后建議分裝上樣，避免反復(fù)凍融。

7、BCA法測(cè)蛋白濃度和蛋白定量時(shí)一定要準(zhǔn)確，否則可能導(dǎo)致后面跑WB內(nèi)參不齊。

如圖為小鼠組織蛋白的免疫印跡圖