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嘉峪檢測(cè)網(wǎng) 2024-11-08 08:11
摘 要： 建立高效液相色譜法測(cè)定熱感賽比斯坦顆粒中的嗎啡含量。采用Waters RP-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）為分離柱，以乙腈-0.01 mol/L磷酸二氫鉀和0.05 mol/L庚烷磺酸鈉混合溶液（pH 3.5）（體積比為5∶95）為流動(dòng)相，流量為1.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為230 nm，柱溫為28 ℃。嗎啡的質(zhì)量濃度在0.24～23.70 μg/mL范圍內(nèi)與色譜峰面積線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)為0.999 9，方法檢出限為0.14 μg/mL，定量限為0.22 μg/mL。樣品加標(biāo)平均回收率為99.05%，測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.62%。該方法適用于熱感賽比斯坦顆粒及原料藥材罌粟殼中嗎啡含量的測(cè)定。
關(guān)鍵詞： 熱感賽比斯坦顆粒； 高效液相色譜法； 嗎啡
熱感賽比斯坦顆粒是由艾克木·穆罕默德·艾扎木汗于1874年撰寫(xiě)的維醫(yī)典籍《醫(yī)科思熱·愛(ài)扎穆》第723頁(yè)收藏的經(jīng)典名方，處方由破布木果、大棗、罌粟殼、甘草等12味藥材組成，其制備工藝為將處方藥材粉碎成粗粉，加水煎煮3次，每次1 h，過(guò)濾，合并濾液后濃縮成膏狀，加入糖粉制成顆粒制劑。該中成藥制劑具有清除異常膽液質(zhì)、止咳、化痰的功效，可用于治療熱性感冒咳嗽、呼吸道感染等癥狀[1]。其處方中的罌粟殼為罌粟科植物罌粟Papaver somniferum L.的干燥成熟果實(shí)，味酸澀，性平，專治久咳、久瀉、脫肛、脘腹疼痛[2]。現(xiàn)代藥理及化學(xué)研究表明，罌粟殼藥材主要藥效成分為生物堿類，其中以嗎啡為主，具有顯著的鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)咳作用，并能使胃腸道及其括約肌的張力提高、消化液分泌減少、便意遲鈍，從而起到止瀉的作用[3]。在中成藥中罌粟殼藥材常作為處方原料用于治療久咳、久瀉等癥狀[4?5]，但同時(shí)它具有成癮性，當(dāng)人體攝入嗎啡達(dá)到一定量時(shí)會(huì)產(chǎn)生精神依賴性[6?7]，因此控制制劑中的嗎啡含量尤為重要。
在《中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部 藥品標(biāo)準(zhǔn) 維吾爾藥分冊(cè)》[8]中僅對(duì)熱感賽比斯坦顆粒中藥材罌粟殼進(jìn)行了定性鑒別，沒(méi)有相關(guān)含量測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)方法，對(duì)該制劑的藥品質(zhì)量和安全性難以進(jìn)行有效控制。目前對(duì)熱感賽比斯坦顆粒中生物堿含量及其他制劑中嗎啡含量的測(cè)定已有相關(guān)報(bào)道[9?10]，但對(duì)于熱感賽比斯坦顆粒及原料藥材罌粟殼中嗎啡含量的測(cè)定還未見(jiàn)報(bào)道。劉新豫等對(duì)熱感賽比斯坦顆粒中生物堿的含量進(jìn)行了測(cè)定[9]，但該方法色譜峰保留時(shí)間較短，易受流動(dòng)相的干擾。筆者通過(guò)優(yōu)化色譜條件和樣品處理?xiàng)l件，建立了高效液相色譜法測(cè)定熱感賽比斯坦顆粒及其處方原料藥材罌粟殼中嗎啡的含量。通過(guò)測(cè)定原料藥材罌粟殼及熱感賽比斯坦顆粒中嗎啡的含量，可明確原料藥材在制劑中的轉(zhuǎn)移率，以確保臨床應(yīng)用的安全性和有效性。該方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確性、專屬性較好，可為該制劑的質(zhì)量和用藥安全提供技術(shù)保障。
1、 實(shí)驗(yàn)部分
1.1 主要儀器與試劑
高效液相色譜儀：Waters e 2695型，沃特世科技(上海)有限公司。
數(shù)控超聲波清洗器：KH-300DE型，昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司。
電子天平：BT125D型，感量為0.01 mg，德國(guó)賽多利斯公司。
甲醇、乙腈：均為色譜純，美國(guó)賽默飛世爾科技公司。
嗎啡對(duì)照品：質(zhì)量分?jǐn)?shù)為98%，批號(hào)為171201-201123，中國(guó)藥品生物制品鑒定所。
熱感賽比斯坦顆粒樣品：批號(hào)分別為20200209、20200215、20200224，新疆和田維吾爾藥業(yè)股份有限公司。
實(shí)驗(yàn)用水為一級(jí)水。
1.2 色譜條件
色譜柱：Waters RP-C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm，美國(guó)沃特世科技有限公司)；柱溫：28 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：230 nm；進(jìn)樣體積：10 μL；流動(dòng)相：乙腈-0.01 mol/L磷酸二氫鉀和0.05 mol/L庚烷磺酸鈉混合溶液(PH 3.5) (體積比為5∶95)；流量：1.0 mL/min。
1.3 溶液配制
嗎啡對(duì)照品溶液：0.237 mg/mL，精密稱取嗎啡對(duì)照品適量，置于10 mL容量瓶中，用20%（除特殊說(shuō)明外，均為體積分?jǐn)?shù)）的甲醇溶液(含5%乙酸)溶解并稀釋至標(biāo)線，混勻，于4 ℃下避光保存。
嗎啡對(duì)照品系列工作溶液：精密量取0.005、0.010、0.025、0.050、0.25、0.50 mL嗎啡對(duì)照品溶液，分別置于5 mL容量瓶中，用20%的甲醇溶液(含5%乙酸)定容至標(biāo)線，搖勻，配制成嗎啡的質(zhì)量濃度分別為0.24、0.47、1.19、2.37、11.85、23.70 μg/mL的系列工作溶液。
1.4 樣品處理
將熱感賽比斯坦顆粒研細(xì)后取3.0 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，加入4 mL氨水，充分濕潤(rùn)，靜置10 min，稱量并記錄其質(zhì)量，加入30 mL三氯甲烷，密封，超聲30 min。冷卻至室溫，再次稱量并記錄其質(zhì)量，加入三氯甲烷補(bǔ)足減失的質(zhì)量，然后過(guò)濾，取20 mL濾液濃縮至近干，加入甲醇定容至10 mL容量瓶中，搖勻，得樣品溶液[8]。
取罌粟殼藥材粉末約0.5 g，精密稱定，同法制備罌粟殼藥材溶液。
按熱感賽比斯坦顆粒處方中藥材比例及制備工藝，制備缺少罌粟殼藥材的陰性樣品，同法制備陰性樣品溶液。
1.5 定量方法
取對(duì)照品溶液、樣品溶液、陰性樣品溶液，按照1.2色譜條件測(cè)定，以色譜峰面積外標(biāo)法計(jì)算嗎啡的含量。
2、 結(jié)果與討論
2.1 色譜條件優(yōu)化
2.1.1 流動(dòng)相選擇
分別選擇乙腈-0.5%乙酸銨溶液(含0.08%三乙胺)、乙腈-0.01 mol/L庚烷磺酸鈉溶液和0.02 mol/L磷酸二氫鉀溶液的等量混合液(用10%磷酸溶液調(diào)節(jié)pH值至2.8)、乙腈-0.01 mol/L磷酸二氫鉀溶液(用5%磷酸溶液調(diào)節(jié)pH值至2.7)、乙腈-0.01 mol/L磷酸二氫鉀和0.05 mol/L庚烷磺酸鈉混合溶液(用5%磷酸溶液調(diào)節(jié)pH值至3.5) (體積比為5∶95)作為流動(dòng)相[11?14]，考察不同流動(dòng)相體系時(shí)目標(biāo)物的分離效果。結(jié)果表明，以乙腈-0.5%乙酸銨溶液(含0.08%三乙胺)、乙腈-0.01 mol/L庚烷磺酸鈉溶液和0.02 mol/L磷酸二氫鉀溶液的等量混合液(pH 2.8)為流動(dòng)相時(shí)，嗎啡出現(xiàn)雙峰；以乙腈-0.01 mol/L磷酸二氫鉀溶液(pH 2.7)為流動(dòng)相時(shí)，色譜峰基線漂移；以乙腈-0.01 mol/L磷酸二氫鉀和0.05 mol/L庚烷磺酸鈉混合溶液(pH 3.5)為流動(dòng)相時(shí)，色譜峰基線平穩(wěn)，嗎啡色譜峰分離度及峰形良好，因此選擇乙腈-0.01 mol/L磷酸二氫鉀和0.05 mol/L庚烷磺酸鈉混合溶液(pH 3.5) (體積比為5∶95)作為流動(dòng)相。
2.1.2 波長(zhǎng)選擇
波長(zhǎng)的選擇對(duì)色譜峰面積有較大影響，繼而影響測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確度。在200～800 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)，掃描嗎啡對(duì)照品溶液。結(jié)果表明，嗎啡的最大吸收波長(zhǎng)為230 nm，故選擇檢測(cè)波長(zhǎng)為230 nm。
2.1.3 柱溫的選擇
色譜柱溫度對(duì)目標(biāo)物的分離效果有較大影響?？疾焐V柱溫度分別為25、28、30 ℃時(shí)嗎啡的分離效果[15?17]。結(jié)果表明，當(dāng)色譜柱溫度在25 ℃時(shí)，色譜峰有拖尾現(xiàn)象，分離度不佳；當(dāng)溫度為30 ℃時(shí)，色譜峰基線漂移且分離度差；當(dāng)溫度為28 ℃時(shí)，色譜峰基線穩(wěn)定，分離度好，因此選擇色譜柱溫度為28 ℃。
2.2 樣品處理?xiàng)l件優(yōu)化
在制備熱感賽比斯坦顆粒樣品溶液時(shí)，分別選擇乙腈-0.01 mol/L磷酸二氫鉀和0.05 mol/L庚烷磺酸鈉混合溶液(pH 3.5)[18]、75%乙醇、75%甲醇和氨水4種溶劑濕潤(rùn)樣品，然后加入三氯甲烷進(jìn)行提取。結(jié)果表明，樣品經(jīng)氨水濕潤(rùn)后，加入三氯甲烷超聲提取，提取溶液中嗎啡色譜峰形良好且峰面積最大，因此在制備樣品溶液時(shí)用氨水濕潤(rùn)樣品后加入三氯甲烷超聲提取。
選擇超聲時(shí)間分別為20、30、40 min進(jìn)行試驗(yàn)。結(jié)果表明，當(dāng)超聲時(shí)間為20 min時(shí)，嗎啡的色譜峰面積小于超聲時(shí)間為30 min和40 min時(shí)的色譜峰面積，而超聲時(shí)間為30 min和40 min時(shí)的色譜峰面積基本相同，考慮到檢測(cè)效率，選擇超聲時(shí)間為30 min。
2.3 方法專屬性
取嗎啡對(duì)照品溶液、熱感賽比斯坦顆粒樣品溶液、罌粟殼藥材溶液、陰性樣品溶液，在1.2色譜條件下分別進(jìn)樣測(cè)定，色譜圖如圖1所示。由圖1可以看出，嗎啡對(duì)照品溶液、熱感賽比斯坦顆粒樣品溶液、罌粟殼藥材溶液在相同的保留時(shí)間處具有同一色譜峰，嗎啡色譜峰分離度大于1.5，理論塔板數(shù)按嗎啡色譜峰計(jì)不低于5 000，而陰性樣品溶液中無(wú)相應(yīng)的色譜峰，表明該方法專屬性良好。
圖1 高效液相色譜圖
Fig. 1 High performance liquid chromatography chart
2.4 線性方程與檢出限
在1.2色譜條件下，分別測(cè)定嗎啡對(duì)照品系列工作溶液，記錄色譜圖，以目標(biāo)物的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(x)，以色譜峰面積為縱坐標(biāo)(y)，繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，得線性方程為y=2.71×106x+1.05×104，相關(guān)系數(shù)為0.999 9。結(jié)果表明，嗎啡的質(zhì)量濃度在0.24～23.70 μg/mL范圍內(nèi)與色譜峰面積線性關(guān)系良好。
取嗎啡對(duì)照品溶液適量，用20%的甲醇溶液(含5%乙酸)逐級(jí)稀釋，在1.2色譜下進(jìn)行測(cè)定，分別以3倍信噪比和10倍信噪比對(duì)應(yīng)的質(zhì)量濃度作為方法檢測(cè)限和定量限。該方法的檢測(cè)限為0.14 μg/mL，定量限為0.22 μg/mL。
2.5 精密度試驗(yàn)
取熱感賽比斯坦顆粒樣品6份，每份3.0 g，精密稱定，按1.4方法制備樣品溶液，在1.2色譜條件下進(jìn)行測(cè)定，記錄色譜峰面積，結(jié)果見(jiàn)表1。由表1可知，測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為1.62%，表明該方法精密度良好。
表1 精密度試驗(yàn)結(jié)果
Tab. 1 Results of precision test
2.6 樣品溶液穩(wěn)定性試驗(yàn)
按1.4方法制備樣品溶液，于室溫下儲(chǔ)存，分別于第0、2、4、6、8、12 h進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜峰面積，結(jié)果見(jiàn)表2。由表2可知，色譜峰面積測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.35%，表明樣品溶液在室溫下放置12 h穩(wěn)定性良好。
表2 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果
Tab. 2 Results of stability test
2.7 樣品加標(biāo)回收試驗(yàn)
取熱感賽比斯坦顆粒樣品9份，平均分為3組，每份3.0 g，精密稱定，按1.4方法制備樣品溶液，在1.2色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定。根據(jù)各組中嗎啡的平均含量，分別精密加入適量的嗎啡對(duì)照品溶液，使嗎啡的加入量分別相當(dāng)于其含量的80%、100%、120%，在1.2色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表3。由表3可知，樣品加標(biāo)平均回收率為99.05%，表明該方法準(zhǔn)確度良好。
表3 樣品加標(biāo)回收試驗(yàn)結(jié)果
Tab. 3 Sample spiked recovery test results
3、 結(jié)語(yǔ)
通過(guò)優(yōu)化色譜條件和樣品處理?xiàng)l件，建立了高效液相色譜法測(cè)定熱感賽比斯坦顆粒中的嗎啡含量。該方法準(zhǔn)確、簡(jiǎn)單、方便，適用于熱感賽比斯坦顆粒及其處方原料藥材罌粟殼中嗎啡的含量測(cè)定，為該制劑的制備以及臨床用藥的安全性提供依據(jù)。
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引用本文： 蔡美玲，唐輝，龐克堅(jiān)，等 . 高效液相色譜法測(cè)定熱感賽比斯坦顆粒中嗎啡含量［J］. 化學(xué)分析計(jì)量，2024，33（9）：90. (CAI Meiling, TANG Hui, PANG Kejian, et al. Determination of morphine content in Regan Saibisitan Granules by high performance liquid chromatography[J]. Chemical Analysis and Meterage, 2024, 33(9): 90.)
來(lái)源：化學(xué)分析計(jì)量
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