您當(dāng)前的位置：檢測資訊 > 科研開發(fā)
嘉峪檢測網(wǎng) 2024-11-09 09:05
體積性肌肉損失通常由創(chuàng)傷事件引起，并可導(dǎo)致嚴(yán)重的功能殘疾。由于組織-水凝膠界面處的水化層，傳統(tǒng)的黏合劑水凝膠在潮濕、出血的傷口中表現(xiàn)出較差的組織粘附性，導(dǎo)致性能不足。在這項(xiàng)研究中，我們開發(fā)了一種新型的，由葡聚糖醛和明膠組成的濕組織粘合劑粉末水凝膠。該粉末吸收組織上的界面組織液和緩沖溶液，自發(fā)形成水凝膠，并通過各種分子相互作用，包括希夫堿反應(yīng)，強(qiáng)力粘附在組織上。我們的濕粘粉末水凝膠可以作為修復(fù)各種組織的有效平臺，包括心臟，肌肉和神經(jīng)組織。
引言
骨骼肌約占體重的30-40%，主要負(fù)責(zé)身體運(yùn)動(dòng)和產(chǎn)生力量。骨骼肌經(jīng)常受到不同程度的創(chuàng)傷損傷。創(chuàng)傷性事件常導(dǎo)致體積性肌肉損失(VML)，骨骼肌總量損失大于20%，導(dǎo)致不可逆的肌肉損失、功能受損和長期殘疾。目前臨床治療VML的標(biāo)準(zhǔn)是自體肌瓣移植，然而，它有幾個(gè)嚴(yán)重的缺點(diǎn)，包括復(fù)雜的外科手術(shù)，有限的供體部位的可用性和不完全的功能恢復(fù)。因此，迫切需要一種簡單有效的治療方法來促進(jìn)VML骨骼肌再生。
粉末水凝膠被開發(fā)出來，通過吸收界面水來消除組織界面水化層，從而實(shí)現(xiàn)濕組織粘附。制備的水凝膠具有較強(qiáng)的組織黏附性，為組織再生提供穩(wěn)定、貼身的支持。粉末水凝膠為組織再生提供了幾個(gè)好處，包括快速和大體積去除組織上的水化層，以及適應(yīng)形狀不規(guī)則的傷口部位。一些研究已經(jīng)證明了粉末水凝膠在各種組織再生中的效用。此外，它在動(dòng)態(tài)環(huán)境中的穩(wěn)定性和性能，包括骨骼肌，仍未被探索。因此，開發(fā)具有良好生物相容性、生物可降解性、對動(dòng)態(tài)濕組織具有可靠和強(qiáng)粘附性的粉狀水凝膠是人們迫切需要的。
大多數(shù)研究僅關(guān)注其對出血傷口的止血性能，尚未探討其在組織再生中的適用性。重要的是，由高度改性聚合物組成的粉末可能會引起嚴(yán)重的毒性，副反應(yīng)以及影響再現(xiàn)性的合成和純化困難。為了解決這些問題，我們的研究通過結(jié)合生物相容性天然聚合物，特別是葡聚糖醛(dex-ald)和明膠，開發(fā)了一種濕組織粘合劑聚合物粉末水凝膠，旨在VML后骨骼肌再生。通過簡單的改性工藝合成Dex-ald，并與明膠配制，最終得到Dex-ald/明膠粉末。dex-ald/明膠粉末吸收界面組織液，并通過組織上dex-ald和明膠之間的希夫堿反應(yīng)自發(fā)形成原位水凝膠。此外，這種粉末水凝膠主要通過在水凝膠和組織之間形成共價(jià)席夫堿而粘附在組織上。我們系統(tǒng)地研究了粉末成分和處理程序?qū)Σ牧闲阅艿挠绊?，如機(jī)械、流變學(xué)和附著力。此外，我們還利用各種器官對粉末水凝膠的體內(nèi)性能進(jìn)行了評估，特別是考察了其黏附強(qiáng)度和止血能力，并與其他濕性水凝膠和纖維蛋白膠進(jìn)行了比較。最后，通過動(dòng)物VML模型驗(yàn)證了粉末水凝膠用于骨骼肌再生的可行性。
結(jié)果與討論
1.1.dex-ald/明膠粉末水凝膠的制備
將凍干的Dex-ald和明膠混合勻漿，制備Dex-ald/明膠粉末(圖2A)。均質(zhì)后，用300μm篩進(jìn)行篩分。Dex-ald粉末具有短而破碎的纖維形狀，明膠粉末顯示出球形形態(tài)。粉末的小粒徑被期望具有大的表面積以進(jìn)行快速流體吸附，從而導(dǎo)致快速水化和凝膠化(圖2B)。由于界面水大部分被粉末除去，因此在組織/水凝膠界面上沒有水化層，這使得粉末的粘附官能團(tuán)(如醛、羧基、胺和羥基)能夠有效地反應(yīng)并與組織結(jié)合。由于這些特性，dex-ald/明膠粉末水凝膠可以很強(qiáng)地粘附在濕組織上。用FT-IR光譜檢測PBS處理后形成的粉末水凝膠(圖2C)。Dex-ald和明膠在1735cm−1和1633cm−1處表現(xiàn)出典型的醛鍵峰和酰胺鍵峰。(圖2c)。在dex-ald/明膠水凝膠光譜中，在1056cm−1處出現(xiàn)了席夫堿對應(yīng)的新峰，而在1735cm−1處的醛峰減弱，表明水凝膠中席夫堿形成成功。進(jìn)一步孵育后，水凝膠呈現(xiàn)相對均勻的孔隙，表明最終發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)，內(nèi)部結(jié)構(gòu)均勻。
1.2.dex-ald/明膠粉末水凝膠的力學(xué)特性
通過改變dex-ald與明膠的比例(1:2、1:4、1:8和1:16)，配制出各種dex-ald/明膠粉末，分別稱為粉末(1:2)、粉末(1:4)、粉末(1:8)和粉末(1:16)，并對其流變特性進(jìn)行了表征(圖3)。首先，在時(shí)間掃描模式下監(jiān)測了PBS處理后粉末水凝膠的流變行為(圖3A和B)。加入PBS后，觀察到兩種不同的模量趨勢-(i)初始模量下降和(ii)模量逐漸增加。對于這一觀察，我們推測粉末可能經(jīng)歷的兩個(gè)事件:(i)初始粉末水化與降低模量和(ii)最終交聯(lián)(凝膠)與增加模量。在水化和凝膠化過程中，彈性模量(G′)均高于粘性模量(G″)，表明粉末水凝膠主要表現(xiàn)為凝膠樣行為。由于粉末能迅速吸收溶液，腫脹的粉末即使在早期水化階段也可能表現(xiàn)出凝膠狀的機(jī)械行為。顆粒狀水凝膠(由水合微凝膠組成)即使沒有很強(qiáng)的顆粒間相互作用，其G′也比G′高。在我們的研究中，含有更高比例明膠的粉末表現(xiàn)出更快的水化和更短的凝膠時(shí)間(圖3C)。粉末(1:2)需要很長時(shí)間(約490秒)才能凝膠化，這對于體內(nèi)應(yīng)用來說太慢了。此外，明膠比例較高的粉末水凝膠具有更高的模量(圖3D)。我們通過在PBS中孵育制備的粉末水凝膠進(jìn)一步檢查凝膠穩(wěn)定性。醛基密集地位于dex-ald鏈上(每葡萄糖單位0.58個(gè)醛基)，由于空間位阻，它們與明膠中的胺基反應(yīng)無效。因此，形成穩(wěn)定的交聯(lián)水凝膠需要醛的含量高于胺的含量。粉末(1:4)中胺基比醛基多3.3倍(圖3E)?；谀z時(shí)間、模量和穩(wěn)定性，確定了1:4的粉狀水凝膠最適合作為原位成型粉狀水凝膠。
1.3.dex-ald/明膠粉末水凝膠的組織粘附性
采用豬皮膚組織進(jìn)行搭接剪切試驗(yàn)，評估不同比例(1:2、1:4、1:8和1:16)的粉末水凝膠的組織粘附性(圖4A)。與商業(yè)纖維蛋白膠(2.8kPa)相比，粉末水凝膠具有更高的粘附強(qiáng)度(7.5-15.2kPa)(圖4B)。粉末水凝膠的強(qiáng)組織粘附性可歸因于組織/水凝膠界面上的共價(jià)鍵和非共價(jià)鍵。dex-ald中的醛基可以與組織中的胺基形成共價(jià)席夫堿，這主要有助于組織的粘附。高明膠比(≥1:4)的粉狀水凝膠的粘接強(qiáng)度顯著高于粉狀(1:2)水凝膠(7.5kPa)。
粉末(1:4)水凝膠在模擬體內(nèi)骨骼肌運(yùn)動(dòng)的各種變形條件下(彎曲和扭轉(zhuǎn))表現(xiàn)出穩(wěn)定的組織粘附性(圖4C)。此外，粉末(1:4)水凝膠即使在水中變形和水沖洗后仍保持穩(wěn)定，表明在潮濕環(huán)境中具有良好的附著力和穩(wěn)定性。因此，粉狀(1:4)水凝膠具有較強(qiáng)且穩(wěn)定的組織粘附性，適合于VML骨骼肌再生。
1.4.dex-ald/明膠粉末水凝膠的細(xì)胞相容性
通過直接和間接接觸培養(yǎng)方式培養(yǎng)小鼠C2C12成肌細(xì)胞來評估粉末水凝膠的細(xì)胞相容性(圖5)。在這兩種培養(yǎng)方式下，用水凝膠培養(yǎng)的細(xì)胞在第1、2和3天的存活率都很高(>97%)，與在組織培養(yǎng)板(TCP)上培養(yǎng)的細(xì)胞沒有顯著差異(圖5A和B)。用WST-1法測定代謝活性3天，以研究粉末水凝膠對細(xì)胞增殖的影響(圖5C)。與對照組(TCP)相似，用粉末水凝膠培養(yǎng)的C2C12細(xì)胞在間接接觸和直接接觸兩種方式下均具有良好的增殖能力，且在培養(yǎng)過程中，粉末水凝膠組和TCP組的代謝活性無顯著差異。這些結(jié)果表明，我們的粉末水凝膠不會損害細(xì)胞活力或代謝活性。粉末水凝膠優(yōu)異的細(xì)胞相容性可能與粉末水凝膠成分(明膠和葡聚糖)固有的生物相容性有關(guān)。
1.5.dex-ald/明膠粉末水凝膠的體內(nèi)粘附性、止血性和可降解性
我們通過檢查dex-ald/明膠粉末水凝膠的組織粘連性、止血能力和可降解性來檢驗(yàn)其作為組織粘連性水凝膠在體內(nèi)應(yīng)用的可行性。水凝膠的適當(dāng)組織粘附對于提供受動(dòng)態(tài)運(yùn)動(dòng)的組織(如骨骼肌)之間的可靠連接以及穩(wěn)定地支持組織再生非常重要。我們研究了粉末(1:4)水凝膠和各種對照(預(yù)成型水凝膠、原位成型水凝膠和商業(yè)纖維蛋白膠)的體內(nèi)組織粘附性，并比較了它們的特性(圖6)。注意，預(yù)成型和原位成型水凝膠與粉末水凝膠的組成相同。我們使用各種器官評估水凝膠樣品，包括出血器官(例如，VML損傷的出血性小鼠TA肌和出血性大鼠心臟)和非出血器官(大鼠肝臟、胃和腸)。每個(gè)水凝膠都受到水濺在器官上，以評估其附著力和穩(wěn)定性。在VML損傷的出血性TA肌中，粉末水凝膠和纖維蛋白膠保持穩(wěn)定，與損傷部位粘附良好(圖6B和C)。相比之下，在相同條件下，預(yù)形成和原位形成的水凝膠很容易脫落。特別是，預(yù)先形成的水凝膠不粘附在任何器官上。原位形成的水凝膠僅粘附在非出血器官上(圖6C)。結(jié)果表明，這些類型的水凝膠(預(yù)成型水凝膠和原位成型水凝膠)不適合治療無敷料或縫合的傷口。纖維蛋白膠穩(wěn)定粘附在出血器官上;然而，它與肝臟的粘附不穩(wěn)定，可能是因?yàn)樗谋砻婀饣?。相反，粉末水凝膠粘附在所有器官上，包括出血的VML和心臟。我們的粉末水凝膠具有優(yōu)異的組織黏附性，這是因?yàn)楦稍锏膁exald/明膠粉末可以吸收傷口的界面生物液體或血液，并有效地與組織相互作用。
止血對骨骼肌再生很重要。止血材料可以促進(jìn)骨骼肌的再生，這種止血材料可以快速吸收血液，富集凝血因子，增強(qiáng)組織粘連，并對受傷肌肉進(jìn)行物理保護(hù)。在我們的研究中，使用小鼠出血性肝模型評估了纖維蛋白膠、預(yù)成型水凝膠、原位成型水凝膠和dex-ald/明膠粉(1:4)的體內(nèi)止血能力(圖6D和E)。未經(jīng)任何治療(對照組)，大量失血量(220±35mg)。同樣，預(yù)先形成的水凝膠治療也沒有減少失血量(157±20mg)。纖維蛋白膠組(65±8mg)和原位形成的水凝膠組(80±21mg)的失血量顯著減少。重要的是，粉末水凝膠組的失血量最低(14±4mg)，證實(shí)了dex-ald/明膠粉末具有良好的止血能力，有利于傷口愈合。
1.6.利用dex-ald/明膠粉末水凝膠進(jìn)行體內(nèi)骨骼肌再生
通過VML和水凝膠處理后1周和3周的TA肌肉組織學(xué)分析，檢測dex-ald/明膠粉(1:4)水凝膠對VML損傷后骨骼肌再生的功效(圖7A)。我們包括未治療組和纖維蛋白膠治療組作為對照。粉末凝膠組在1周和3周時(shí)發(fā)現(xiàn)明顯的再生組織覆蓋缺損，比未處理組和纖維蛋白膠組大(圖7B)。VML后TA肌中的中心核肌纖維主要作為肌肉再生的指標(biāo)進(jìn)行分析。1周和3周時(shí)，粉末水凝膠組再生肌纖維面積明顯高于纖維蛋白膠組和未處理組(圖7C)。例如，1周時(shí)，未處理組、纖維蛋白膠組和粉末水凝膠組損傷區(qū)域內(nèi)再生肌纖維的平均面積分別為209±23、237±14和304±39μm2;3周時(shí)，未處理組、纖維蛋白膠組和粉末水凝膠組的再生肌纖維面積分別為438±80、468±58和703±127μm2。第1周和第3周再生肌纖維區(qū)域的分布表明，粉末水凝膠組的大纖維數(shù)量多于未處理組和纖維蛋白膠組(圖7D)。這些結(jié)果表明，粉末水凝膠對VML損傷后肌肉再生有顯著促進(jìn)作用。通過分析馬松三色染色圖像中的膠原沉積來評估瘢痕組織的形成(圖7E)。與其他組相比，粉末凝膠組TA肌力的恢復(fù)最大，而纖維蛋白膠處理也比未處理的對照組促進(jìn)了肌力的恢復(fù)。例如，未治療組、纖維蛋白膠組和粉末膠組的肌力恢復(fù)率分別為38.2±5.5%、53.6±11.0%和89.0±5.5%。這種功能性肌肉力量恢復(fù)的改善與組織學(xué)評估中觀察到的趨勢(例如，有核肌纖維區(qū)域)密切相關(guān)。
肌肉再生不足或不適當(dāng)通常伴隨著病理性組織重塑和纖維化。VML損傷治療1周后，粉末水凝膠組的纖維化面積較未治療組明顯縮小(圖7F)。3周后，各組纖維化面積均減小，且纖維化面積均小于對照組。如未治療組、纖維蛋白膠組、粉末水凝膠組3周纖維化面積分別為26.3±3.5%、24.5±2.9%、18.9±2.4%。上述結(jié)果表明，粉末水凝膠處理具有較強(qiáng)的組織粘連性和機(jī)械支持作用，可顯著促進(jìn)VML損傷后骨骼肌再生，瘢痕組織減少。
除了提供充足的氧氣和營養(yǎng)物質(zhì)外，血管化還可以激活常駐衛(wèi)星細(xì)胞，促進(jìn)肌肉祖細(xì)胞向損傷部位遷移以進(jìn)行肌肉再生。因此，在樣本處理的肌肉組織血管化分析，以評估骨骼肌再生。治療1周后，與未治療組相比，粉末水凝膠組損傷組織中新血管形成增加(圖8A)。3周后，各組血管形成進(jìn)一步增強(qiáng)，粉狀水凝膠組血管形成高于未處理組和纖維蛋白膠組。此外，由于巨噬細(xì)胞在炎癥中起關(guān)鍵作用，我們通過組織巨噬細(xì)胞的免疫染色檢查了損傷部位的炎癥組織反應(yīng)。巨噬細(xì)胞可以誘導(dǎo)或消除炎癥，這取決于它們的微環(huán)境。巨噬細(xì)胞分化為炎癥型(M1)或抗炎型(M2)。過多的炎性巨噬細(xì)胞會放大炎癥并誘導(dǎo)瘢痕組織形成。在我們的研究中，表型VML損傷部位的巨噬細(xì)胞通過F4/80(一種泛巨噬細(xì)胞標(biāo)記物)和CD206(一種抗原)雙重染色進(jìn)行評估抗炎巨噬細(xì)胞標(biāo)記)(圖8B)。治療1周后，粉水凝膠組F4/80(+)/CD206(+)細(xì)胞出現(xiàn)頻率明顯高于其他組?？寡?M2)巨噬細(xì)胞可促進(jìn)成肌細(xì)胞生長和分化，促進(jìn)骨骼肌再生?？傊?，粉末水凝膠治療促進(jìn)了血管生成和抗炎組織反應(yīng)，從而改善了骨骼肌再生，減少了疤痕組織。
結(jié)論
我們成功地開發(fā)了濕粘粉，它可以吸收傷口界面的水，并形成具有強(qiáng)組織粘附力的水凝膠，使用生物相容性和可生物降解的凝膠和明膠。由1:4(dex-ald:明膠)比例組成的dex-ald/明膠粉末顯示出有利于骨骼肌再生的特性，例如即使在潮濕環(huán)境中也能與傷口部位強(qiáng)粘附，具有機(jī)械支撐、止血和可降解性。粉末水凝膠顯著改善骨骼肌再生，減少瘢痕組織形成。免疫組織學(xué)分析顯示，粉末水凝膠可誘導(dǎo)VML損傷骨骼肌血管生成和抗炎巨噬細(xì)胞極化。總的來說，我們的dex-ald/明膠粉末水凝膠在促進(jìn)VML損傷骨骼肌再生方面表現(xiàn)出顯著的功效，將為開發(fā)基于生物材料的各種組織再生策略提供一個(gè)有前景的平臺。
原文信息
The title of the article is “Wet tissue adhesive polymeric powder hydrogels for skeletal muscle regeneration”,
DOI: 10.1016/j.bioactmat.2024.06.017
來源：Internet
關(guān)于我們 聯(lián)系我們 營業(yè)執(zhí)照 全國服務(wù)電話：400-818-0021 嘉峪檢測版權(quán)所有 備案號：京ICP備14047019號-2 
京公網(wǎng)安備11010802046783號
