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蛋白質(zhì)的分離純化是用生物工程下游技術(shù)從混合物當(dāng)中分離純化出所需要的目的蛋白質(zhì)的方法。隨著生物技術(shù)的發(fā)展，越來越多的蛋白質(zhì)及多肽鏈通過基因工程、蛋白質(zhì)工程以及發(fā)酵工程等生物技術(shù)的運(yùn)用被計(jì)、制造及生產(chǎn)出來。為了研究應(yīng)用某一個(gè)蛋白質(zhì)，必須首先將目的蛋白質(zhì)從混合的蛋白質(zhì)分子和非一些蛋白質(zhì)分子中分離出來。因此，重組蛋白的分離純化在生物化學(xué)研究應(yīng)用中使用廣泛，是一項(xiàng)重要的操作技術(shù)。

 

蛋白質(zhì)分離純化的一般步驟 

 

1、材料的預(yù)處理及細(xì)胞破碎

分離提純某一種蛋白質(zhì)時(shí)，需要根據(jù)蛋白表達(dá)的方式對(duì)其進(jìn)行預(yù)處理。對(duì)于胞內(nèi)表達(dá)的蛋白，首先要把蛋白質(zhì)從組織或細(xì)胞中釋放出來并保持原來的天然狀態(tài)，不喪失活性。

 

所以要采用適當(dāng)?shù)姆椒▽⒔M織和細(xì)胞破碎。常用的破碎組織細(xì)胞的方法如下：

 

研缽和研杵

研磨破壁法通常是將植物組織樣本放在置于冷凍液氮中，通過組織研磨器的研磨來完成的。當(dāng)組織材料被破壞時(shí)，可以通過添加溶劑來提取代謝物。

 

珠磨法

珠磨法是指在等量的細(xì)胞懸液和渦旋混合器中加入玻璃珠或磁珠用于通過固體剪切的作用來使細(xì)胞裂解的方法。

 

這種細(xì)胞裂解法的機(jī)械剪切力足夠溫和，可以保持細(xì)胞器的完整性，具有較高的細(xì)胞破碎率可大規(guī)模使用，適用于各種細(xì)胞破碎。缺點(diǎn)是：大分子內(nèi)容物較易失活，并且漿液分離較為困難。

 

超聲波破碎儀

超聲波均質(zhì)器的工作原理是在浸入細(xì)胞溶液中的鈦探針中引起振動(dòng)。發(fā)生稱為空化的過程，其中微小氣泡形成并爆炸，產(chǎn)生局部沖擊波并通過壓力變化破壞細(xì)胞壁。

 

這種方法非常適用于植物和真菌細(xì)胞，但有一個(gè)缺點(diǎn)：噪音較大，所以使用時(shí)，必須在額外的房間內(nèi)進(jìn)行。

 

均質(zhì)機(jī)破碎法

均質(zhì)器在細(xì)胞上使用類似于珠法的剪切力?？梢酝ㄟ^將細(xì)胞擠壓到比它們略小的管子中來進(jìn)行均質(zhì)化，從而剪掉外層（法壓）或使用攪拌機(jī)中的旋轉(zhuǎn)刀片（轉(zhuǎn)子-定子處理器）。

 

冷凍破碎法

凍融循環(huán)通過在解凍時(shí)形成冰晶和細(xì)胞膨脹來起作用，最終導(dǎo)致破裂。用于藻類和軟植物材料。缺點(diǎn)是非常耗時(shí)。

 

高溫破碎法

高溫和壓力會(huì)破壞細(xì)胞壁內(nèi)的鍵，也會(huì)使蛋白質(zhì)變性。盡管速度很快，但如果您的應(yīng)用受到熱對(duì)電池其余部分的損害影響，您最好找到另一種方法。

 

酵素

天然存在的酶可用于去除細(xì)胞壁，例如在分離原生質(zhì)體時(shí)，根據(jù)您使用的生物組織樣本，可以使用纖維素酶、幾丁質(zhì)酶、溶菌酶、甘露糖酶、聚糖酶等溶菌酶。

 

 

 

2、蛋白質(zhì)的抽提

在蛋白質(zhì)的抽提過程中，通常選擇適當(dāng)?shù)娜軇┌训鞍踪|(zhì)提取出來。抽提所用緩沖液溶劑的組成成分、pH、離子強(qiáng)度等條件的選擇應(yīng)根據(jù)欲制備的蛋白質(zhì)的性質(zhì)而定。

 

如膜蛋白的抽提，抽提緩沖液中一般要加入表面活性劑 ，使膜結(jié)構(gòu)破壞，利于蛋白質(zhì)與膜分離。在抽提過程中，應(yīng)注意溫度，避免劇烈攪拌等，以防止蛋白質(zhì)的變性。細(xì)胞碎片等不溶物可用離心或過濾的方法除去。

 

等電點(diǎn)沉淀法

不同蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)不同，可用等電點(diǎn)沉淀法使它們相互分離。

 

鹽析法

鹽析是指在蛋白質(zhì)水溶液中加入中性鹽，隨著鹽濃度增大而使蛋白質(zhì)沉淀出來的現(xiàn)象。鹽析是依據(jù)蛋白質(zhì)溶解度不同進(jìn)行分離的技術(shù)。

 

中性鹽是強(qiáng)電解質(zhì)，溶解度又大，在蛋白質(zhì)溶液中，一方面與蛋白質(zhì)爭(zhēng)奪水分子，破壞蛋白質(zhì)膠體顆粒表面的水膜；

 

另一方面又大量中和蛋白質(zhì)顆粒上的電荷，從而使水中蛋白質(zhì)顆粒積聚而沉淀析出。常用的中性鹽有硫酸銨、氯化鈉、硫酸鈉等，但以硫酸銨為最多。

 

鹽析得到的蛋白質(zhì)一般不失活，一定條件下又可重新溶解，因此這種沉淀蛋白質(zhì)的方法在分離、濃縮，貯存、純化蛋白質(zhì)的工作中應(yīng)用極廣。

 

有機(jī)溶劑沉淀法

中性有機(jī)溶劑如乙醇、丙酮，它們的介電常數(shù)比水低。能使大多數(shù)球狀蛋白質(zhì)在水溶液中的溶解度降低，進(jìn)而從溶液中沉淀出來，因此可用來沉淀蛋白質(zhì)。

 

此外，有機(jī)溶劑會(huì)破壞蛋白質(zhì)表面的水化層，促使蛋白質(zhì)分子變得不穩(wěn)定而析出。由于有機(jī)溶劑會(huì)使蛋白質(zhì)變性，使用該法要注意在低溫下操作，選擇合適的有機(jī)溶劑濃度。

 

3、樣品的進(jìn)一步分離純化 

用等電點(diǎn)沉淀法、鹽析法所得到的蛋白質(zhì)一般含有其他蛋白質(zhì)雜質(zhì)，須進(jìn)一步分離提純才能得到有一定純度的樣品。常用的純化方法有: 凝膠過濾層析、離子交換纖維素層析、親和層析等。有時(shí)還需要這幾種方法聯(lián)合使用才能得到較高純度的蛋白質(zhì)樣品。

 

凝膠過濾層析法

凝膠過濾層析法又稱為排阻層析或分子篩方法，主要是根據(jù)蛋白質(zhì)的大小和形狀，即蛋白質(zhì)的質(zhì)量進(jìn)行分離和純化。

 

層析柱中的填料是某些惰性的多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)物質(zhì)，多是交聯(lián)的聚糖類物質(zhì)，使蛋白質(zhì)混合物中的物質(zhì)按分子大小的不同進(jìn)行分離，大分子物質(zhì)被排除在外部，流下路程短，先流出來，而小分子物質(zhì)能進(jìn)入層析填料的內(nèi)部，流下時(shí)路程較長(zhǎng)，因此會(huì)后流出來。

 

離子交換層析‍

離子交換層析分離根據(jù)是蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)不同，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)處于不同的pH條件下，蛋白質(zhì)所帶電荷不同而進(jìn)行的分離方法。

 

離子交換層析中，基質(zhì)是由帶有電荷的樹脂或纖維素組成。帶有正電荷的稱之陰離子交換樹脂；而帶有負(fù)電荷的稱之陽(yáng)離子樹脂。常用于蛋白質(zhì)分離的離子交換劑有弱酸型的羧甲基纖維素和弱堿型的二乙基氨基乙基纖維素。

 

疏水作用層析‍

疏水層析也稱疏水作用下層析，從分離純化機(jī)制來看，也屬于吸附層析一類。

 

疏水層析是利用固定相載體上偶聯(lián)的疏水性配基與流動(dòng)相中的一些疏水分子發(fā)生可逆性結(jié)合而進(jìn)行分離。蛋白質(zhì)表面一般有疏水與親水基團(tuán)，疏水層析是利用蛋白質(zhì)表面某一部分具有疏水性，與帶有疏水性的載體在高鹽濃度時(shí)結(jié)合。

 

在洗脫時(shí)，將鹽濃度逐漸降低，因其疏水性不同而逐個(gè)地先后被洗脫而純化，可用于分離其它方法不易純化的蛋白質(zhì)。

 

親和層析

親和層析是一種利用生物分子之間的特異性相互作用來分離分子的色譜方法。

 

親和層析在凝膠過濾色譜柱上鏈接與待分離的物質(zhì)有一定結(jié)合能力的分子，并且它們的結(jié)合是可逆的，在改變流動(dòng)相條件時(shí)二者還能相互分離。

 

親和層析可以用來從混合物中純化或濃縮某一分子，也可以用來去除或減少混合物中某一分子的含量。

 

結(jié)語(yǔ)

 

蛋白質(zhì)的分離純化技術(shù)作為發(fā)酵后處理中關(guān)鍵的一步，操作的合理性直接影響產(chǎn)物最后的產(chǎn)率，對(duì)企業(yè)生產(chǎn)成本，利潤(rùn)直接掛鉤。熟練地掌握蛋白質(zhì)分離純化技術(shù)，并利用合理的方式在保證產(chǎn)量的基礎(chǔ)上提高純度是發(fā)酵后處理值得研究的永恒課題。