中文字幕一级黄色A级片|免费特级毛片。性欧美日本|偷拍亚洲欧美1级片|成人黄色中文小说网|A级片视频在线观看|老司机网址在线观看|免费一级无码激情黄所|欧美三级片区精品网站999|日韩av超碰日本青青草成人|一区二区亚洲AV婷婷

1、石蠟切片的質(zhì)量直接關(guān)系到免疫熒光的染色效果。因此，石蠟切片最好交由技術(shù)熟練的人員操作，新手可能會(huì)存在即便將切片機(jī)調(diào)整至3 μm但實(shí)際厚度遠(yuǎn)大于3 μm的情況，從而導(dǎo)致切片太厚，細(xì)胞層疊，影響觀察。亦有可能因技術(shù)不熟練而破壞組織結(jié)構(gòu)，影響實(shí)驗(yàn)效果；

（刀片變鈍，明場(chǎng)下明顯的刀痕）

（切片太厚，細(xì)胞堆疊）

2、在進(jìn)行抗原修復(fù)時(shí)，要盡量使抗原修復(fù)液沒過載玻片，以防加熱過程中過度揮發(fā)導(dǎo)致干片，同樣，在其他操作時(shí)也因避免干片現(xiàn)象出現(xiàn)，否則可能會(huì)造成高背景及非特異性標(biāo)記；

3、使用組化筆畫圈時(shí)，最好離組織稍微遠(yuǎn)一點(diǎn)，否則組化筆中的物質(zhì)也有可能附著在組織上，影響染色效果。該操作主要是起到一個(gè)阻隔的作用，主要目的是防止液體外溢。在畫圈時(shí)需要注意稍微等組化圈干一會(huì)兒再進(jìn)行滴加所需物質(zhì)，且最好多畫幾次以防液體外溢，孵育過程中也要時(shí)不時(shí)進(jìn)行觀察，以防干片；

4、熒光二抗的保存以及孵育熒光二抗之后的所有操作均需避光操作，以防熒光猝滅；

5、進(jìn)行圖片采集時(shí)，熒光物質(zhì)受到激發(fā)光激發(fā)后會(huì)立馬猝滅，因此最好先在明場(chǎng)下找好準(zhǔn)備采集的視野后再切換到暗場(chǎng)。對(duì)于顯微鏡的選擇熒光顯微鏡和共聚焦顯微鏡均可，通常共聚焦顯微鏡拍得會(huì)更清楚，但在參數(shù)調(diào)整合適的情況下，熒光顯微鏡拍攝足以滿足日常的拍攝需要，故而無需非要采用共聚焦顯微鏡進(jìn)行拍攝；

6、關(guān)于石蠟切片的保存：短期保存可放置于室溫，如若需要較長(zhǎng)期保存，可將其置于密封袋中，在4℃冰箱保存，但最好在短期內(nèi)使用，放置時(shí)間較長(zhǎng)會(huì)破壞其抗原性，進(jìn)而影響染色效果；

7、關(guān)于定位出錯(cuò)或無標(biāo)記：比如原本定位在核的染到了質(zhì)上，或者核質(zhì)均有等情況。從以下幾點(diǎn)考慮：抗體是否得到了妥善保存，DAPI染液是否過期，抗原修復(fù)是否到位，抗體是否適用于石蠟切片免疫熒光，一抗與二抗的種屬選擇是否正確等；

（DAPI過期，染色模糊）

8、關(guān)于高背景：考慮洗滌是否徹底，所用封閉血清的質(zhì)量，脫蠟是否徹底，是否有干片現(xiàn)象，是否滴加了過多DAPI等；

9、關(guān)于自發(fā)熒光：石蠟切片免疫熒光不可避免會(huì)產(chǎn)生自發(fā)熒光。因此，脫蠟必須徹底，封閉、洗滌等過程也需充分；抗體在使用前最好先離心處理并盡量從上方吸取，抗體的濃度過高也會(huì)產(chǎn)生自發(fā)熒光，所以可以預(yù)實(shí)驗(yàn)摸清最合適的抗體濃度再進(jìn)行正式實(shí)驗(yàn)；如若自發(fā)熒光很強(qiáng)，嚴(yán)重影響染色效果，亦可采用自發(fā)熒光去除劑進(jìn)行去除；

10、關(guān)于透膜：透膜通常采用曲拉通（Triton X-100），且一般采用0.1%的濃度。但對(duì)于石蠟切片需不需要透膜也是存在不同觀點(diǎn)，有的觀點(diǎn)認(rèn)為需要透膜，有的觀點(diǎn)則認(rèn)為切片過程中已經(jīng)將核暴露了出來，所以石蠟切片免疫熒光沒有必要用，做細(xì)胞的才用；另有觀點(diǎn)認(rèn)為與蛋白有關(guān)，若目的蛋白為核蛋白，則需要用；若目的蛋白在胞質(zhì)，則不需要用。此外，對(duì)于透膜的時(shí)間也是各有不同，有的會(huì)將其與封閉液混合進(jìn)而處理1h，有的則與一抗混合，過夜處理。個(gè)人認(rèn)為具體情況按自己的實(shí)驗(yàn)結(jié)果來定，一次性設(shè)置多個(gè)對(duì)照組摸清條件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，比如我們課題組之前實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，透不透膜對(duì)我們所做的目的蛋白定位毫無影響，但透膜處理反而影響與其共染的另一個(gè)蛋白的著色效果，所以后期就沒進(jìn)行透膜處理；

11、關(guān)于DAPI染色：過多的DAPI染液會(huì)帶來高背景，影響觀察，所以只需要薄薄一層，覆蓋組織即可，當(dāng)然目前市面上有的抗熒光衰減封片劑里已經(jīng)包含了DAPI染液，無需單獨(dú)染色；

12、關(guān)于封片：一般情況下染色完畢后會(huì)立即進(jìn)行拍攝采圖，而拍攝后熒光很快猝滅，中性樹膠也會(huì)帶來自發(fā)熒光，所以封片的意義不太大。一般滴加抗熒光衰減封片劑后蓋上蓋玻片進(jìn)行觀察即可，如若擔(dān)心蓋玻片移動(dòng)，可在蓋玻片四周用中性樹膠進(jìn)行固定。

（脫片導(dǎo)致組織堆疊）

13、關(guān)于半定量分析：免疫熒光的半定量分析一直以來爭(zhēng)議都比較大，有的專家認(rèn)為太多的主觀因素混雜其中導(dǎo)致這一分析結(jié)果過于主觀而無分析意義，而有的專家也認(rèn)為只是大致進(jìn)行分析，所以還是有必要分析的，所以大家視情況而定即可。