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嘉峪檢測(cè)網(wǎng) 2024-11-12 13:54
剛剛，國(guó)家藥監(jiān)局發(fā)布《人類白細(xì)胞抗原（HLA）基因分型檢測(cè)試劑注冊(cè)審查指導(dǎo)原則（征求意見稿）》，內(nèi)容如下：
人類白細(xì)胞抗原（HLA）基因分型檢測(cè)試劑注冊(cè)審查指導(dǎo)原則
（征求意見稿）
本指導(dǎo)原則旨在指導(dǎo)注冊(cè)申請(qǐng)人（以下簡(jiǎn)稱“申請(qǐng)人”）對(duì)人類白細(xì)胞抗原（human leukocyte antigen, HLA）基因分型檢測(cè)試劑注冊(cè)申報(bào)資料的準(zhǔn)備及撰寫，同時(shí)也為技術(shù)審評(píng)部門提供參考。
本指導(dǎo)原則是對(duì)HLA基因分型檢測(cè)試劑的一般要求，申請(qǐng)人應(yīng)依據(jù)產(chǎn)品的具體特性確定其中內(nèi)容是否適用。若不適用，需具體闡述理由及相應(yīng)的科學(xué)依據(jù)，并依據(jù)產(chǎn)品的具體特性對(duì)注冊(cè)申報(bào)資料的內(nèi)容進(jìn)行充實(shí)和細(xì)化。
本指導(dǎo)原則為注冊(cè)申請(qǐng)人和技術(shù)審評(píng)人員使用的指導(dǎo)性文件，但不包括審評(píng)審批所涉及的行政事項(xiàng)，亦不作為法規(guī)強(qiáng)制執(zhí)行，應(yīng)在遵循相關(guān)法規(guī)的前提下使用本指導(dǎo)原則。如果有能夠滿足相關(guān)法規(guī)要求的其他方法，也可以采用，但是需要提供詳細(xì)的研究資料和驗(yàn)證資料。
本指導(dǎo)原則是在現(xiàn)行法規(guī)和標(biāo)準(zhǔn)體系以及當(dāng)前認(rèn)知水平下制定，隨著法規(guī)和標(biāo)準(zhǔn)的不斷完善，以及科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，相關(guān)內(nèi)容也將適時(shí)進(jìn)行調(diào)整。
一、適用范圍
本指導(dǎo)原則適用于基于核酸檢測(cè)技術(shù)定性檢測(cè)人靜脈全血樣本中HLA基因分型的試劑，用于造血干細(xì)胞移植或?qū)嶓w器官移植的配型檢測(cè)。
本指導(dǎo)原則適用的核酸檢測(cè)技術(shù)包括直接測(cè)序法（sequence-based typing, SBT）、聚合酶鏈反應(yīng)-序列特異性引物（polymerase chain reaction-sequence specific primer，PCR-SSP）方法、聚合酶鏈反應(yīng)-序列特異性寡核苷酸雜交（polymerase chain reaction-sequence specific oligonucleotide，PCR-SSO）方法、熒光熔解曲線法和高通量測(cè)序法等。其臨床預(yù)期用途如下：
1. 用于低中分辨率分型，為肝/腎等實(shí)體器官移植供受者的選擇提供參考。
2. 用于高分辨率分型，為造血干細(xì)胞移植配型或肝/腎等實(shí)體器官移植供受者的選擇提供參考。
對(duì)于采用其他樣本類型的檢測(cè)試劑，可能部分要求不完全適用或本文所述內(nèi)容不夠全面；申請(qǐng)人可參考本指導(dǎo)原則，同時(shí)依據(jù)產(chǎn)品特性對(duì)適用部分進(jìn)行評(píng)價(jià)，對(duì)不適用部分闡述不適用的理由，并驗(yàn)證替代方法的科學(xué)合理性。需要時(shí)補(bǔ)充其他必要的評(píng)價(jià)內(nèi)容。
本指導(dǎo)原則針對(duì)相關(guān)產(chǎn)品注冊(cè)申報(bào)資料中的部分內(nèi)容進(jìn)行撰寫，其他未盡事宜應(yīng)當(dāng)符合相關(guān)法規(guī)要求。
二、注冊(cè)審查要點(diǎn)
（一）綜述資料
綜述資料主要包括概述、產(chǎn)品描述、預(yù)期用途、申報(bào)產(chǎn)品上市歷史及其他需說明的內(nèi)容。其中，產(chǎn)品描述詳述技術(shù)原理、產(chǎn)品主要研究結(jié)果的總結(jié)和評(píng)價(jià)、與同類和/或前代產(chǎn)品的比較等。
為便于理解申報(bào)產(chǎn)品設(shè)計(jì)、檢測(cè)原理和結(jié)果判讀方法，充分評(píng)估申報(bào)產(chǎn)品的使用風(fēng)險(xiǎn)，建議在產(chǎn)品描述部分提交申報(bào)產(chǎn)品外包裝及試劑盒中各組分的實(shí)物圖片；以圖示結(jié)合文字的形式描述申報(bào)產(chǎn)品的檢測(cè)原理、結(jié)果判讀和生信分析過程。另外，建議申報(bào)產(chǎn)品明確單樣本檢測(cè)所需時(shí)間，每個(gè)檢測(cè)周期最多可檢測(cè)樣本數(shù)量及檢測(cè)所需時(shí)間（從樣本處理開始至結(jié)果分析結(jié)束）。
與同類和/或前代產(chǎn)品的比較著重從預(yù)期用途、技術(shù)原理、檢測(cè)基因及各等位基因、檢測(cè)分辨率（低分辨率/中分辨率/高分辨率）、主要組成成分、性能指標(biāo)、檢測(cè)所需時(shí)間、臨床應(yīng)用情況等方面詳細(xì)說明申報(bào)產(chǎn)品與已獲批準(zhǔn)的同類/前代產(chǎn)品之間的主要區(qū)別。
預(yù)期用途部分以列表的方式明確申報(bào)產(chǎn)品所能檢測(cè)的HLA基因及具體等位基因，檢測(cè)分辨率（低分辨率/中分辨率/高分辨率），具體的臨床用途如造血干細(xì)胞移植、具體的組織器官移植。因?yàn)椴煌慕M織器官移植考慮的基因分型不同，申報(bào)產(chǎn)品應(yīng)當(dāng)明確具體用于何種器官的移植，同時(shí)詳細(xì)闡述申報(bào)產(chǎn)品所測(cè)基因和具體等位基因可支持預(yù)期用途聲稱的理論依據(jù)（包括診療指南、專家共識(shí)等），提供文獻(xiàn)綜述及各文獻(xiàn)全文。
其他需說明的內(nèi)容部分，概括描述整個(gè)檢測(cè)系統(tǒng)的組成，提供配套申報(bào)產(chǎn)品使用的儀器、試劑和軟件的注冊(cè)信息，提供核酸提取試劑及其他如需提供的說明書。
（二）非臨床資料
1.產(chǎn)品技術(shù)要求及檢驗(yàn)報(bào)告
申請(qǐng)人應(yīng)當(dāng)在原材料質(zhì)量和生產(chǎn)工藝穩(wěn)定的前提下，根據(jù)產(chǎn)品研制、前期評(píng)價(jià)等結(jié)果，依據(jù)相關(guān)文件資料，結(jié)合產(chǎn)品特性按照《醫(yī)療器械產(chǎn)品技術(shù)要求編寫指導(dǎo)原則》的要求編寫。該類產(chǎn)品作為第三類體外診斷試劑，應(yīng)當(dāng)以附錄形式明確主要原材料以及生產(chǎn)工藝要求。同時(shí)，建議在技術(shù)要求附錄中詳細(xì)描述企業(yè)參考品的設(shè)置和制備過程，明確各企業(yè)參考品的樣本類型、基因型和DNA濃度。
第三類體外診斷試劑應(yīng)當(dāng)提供三個(gè)不同生產(chǎn)批次產(chǎn)品的檢驗(yàn)報(bào)告。目前已有適用的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品發(fā)布，技術(shù)要求中應(yīng)當(dāng)體現(xiàn)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品的相關(guān)要求。
2.分析性能研究
申請(qǐng)人應(yīng)當(dāng)提交在符合質(zhì)量管理體系的環(huán)境下生產(chǎn)的試劑盒進(jìn)行的所有分析性能評(píng)估資料，包括具體試驗(yàn)方案、試驗(yàn)數(shù)據(jù)、統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果及結(jié)論等詳細(xì)資料。申報(bào)資料中描述有關(guān)試驗(yàn)的背景信息，包括試驗(yàn)地點(diǎn)，采用的試劑名稱、規(guī)格和批號(hào)，儀器名稱和型號(hào)，樣本的背景信息（來源、樣本編號(hào)、樣本類型、采集及處理方式、基因型和濃度確認(rèn)方法及結(jié)果）等。分析性能評(píng)估用樣本為真實(shí)樣本和IHIW（International HLA and Immunogenetics Workshop ）參考盤，如聲稱多個(gè)適用儀器，分別針對(duì)不同適用儀器進(jìn)行性能評(píng)估研究。
分析性能評(píng)估的試驗(yàn)方法可以參考國(guó)際或國(guó)內(nèi)有關(guān)體外診斷試劑性能評(píng)估的指導(dǎo)原則進(jìn)行，對(duì)于本類產(chǎn)品建議著重對(duì)以下分析性能進(jìn)行研究。
2.1適用的樣本類型
考慮到不同抗凝劑對(duì)核酸檢測(cè)過程產(chǎn)生的影響不同，若適用多種抗凝劑，建議通過同源比對(duì)研究一定數(shù)量的臨床樣本驗(yàn)證各種抗凝劑的適用性。
2.2準(zhǔn)確度
準(zhǔn)確度研究可選擇與同類已上市產(chǎn)品采用真實(shí)全血樣本進(jìn)行方法學(xué)比對(duì)，也可選擇檢測(cè)參考盤如IHIW參考盤、UCLA參考盤等進(jìn)行一致性分析。研究所納入樣本基因型包含檢測(cè)范圍內(nèi)的中國(guó)人群常見等位基因（Common alleles）和確認(rèn)等位基因（Well-documented alleles），具體等位基因參考現(xiàn)行版《中國(guó)常見及確認(rèn)的HLA 等位基因表(CWD)》，并建議納入罕見等位基因（Rare alleles)。另外，考慮到雜合子樣本的檢出錯(cuò)誤率高于純合子，準(zhǔn)確度研究中應(yīng)當(dāng)納入部分雜合子樣本。在樣本數(shù)量上，每個(gè)等位基因的樣本量應(yīng)當(dāng)滿足統(tǒng)計(jì)學(xué)要求，證明每個(gè)等位基因的一致性的單邊95%下限置信限超過0.95。同時(shí)準(zhǔn)確度研究應(yīng)當(dāng)模擬真實(shí)使用情況，每個(gè)樣本僅檢測(cè)一次，不可重復(fù)檢測(cè)。
2.3精密度
精密度研究所用樣本為真實(shí)全血樣本，包括CWD表中的常見等位基因和WD基因，并包含一定數(shù)量的雜合子。濃度水平至少包括最低檢出限濃度水平，建議納入正常濃度和高濃度水平樣本。同時(shí)精密度研究所用樣本與準(zhǔn)確度研究所用樣本不同，不可重復(fù)使用。
考慮到HLA 基因分型檢測(cè)試劑所用方法學(xué)如SSP、SBT、熔解曲線法和高通量測(cè)序法的操作步驟較多，結(jié)果判讀較為復(fù)雜，受人員操作熟練度和儀器的影響較大。因此，在精密度研究中，納入不同熟練程度的操作人員、不同實(shí)驗(yàn)地點(diǎn)、不同實(shí)驗(yàn)儀器、不同試劑批次和檢測(cè)時(shí)間等影響因素。
精密度研究包括重復(fù)性、中間精密度和再現(xiàn)性?？紤]到申報(bào)產(chǎn)品的檢測(cè)用時(shí)較長(zhǎng)，檢測(cè)所需樣本較多，建議申請(qǐng)人在設(shè)計(jì)精密度研究方案時(shí)將重復(fù)性、中間精密度和再現(xiàn)性精密度研究進(jìn)行組合研究。組合研究的總體研究時(shí)長(zhǎng)不少于20天，至少在3個(gè)不同的實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行，每個(gè)實(shí)驗(yàn)室均使用同一型號(hào)不同序列號(hào)的儀器，不同實(shí)驗(yàn)室采用不同熟練程度的操作人員（申報(bào)產(chǎn)品的研發(fā)人員、經(jīng)培訓(xùn)后的目標(biāo)使用人員）；整個(gè)研究至少包含3個(gè)試劑批次，每個(gè)試劑批次至少在不連續(xù)的5天中使用，每天建議包含上午和下午兩個(gè)檢測(cè)輪次，每個(gè)檢測(cè)輪次建議設(shè)置重復(fù)樣本。
研究結(jié)束后對(duì)每個(gè)樣本的重復(fù)性精密度、批間差、中間精密度和再現(xiàn)性精密度進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。每個(gè)樣本的每次檢測(cè)結(jié)果應(yīng)當(dāng)與目標(biāo)結(jié)果一致，當(dāng)產(chǎn)生不一致結(jié)果時(shí)，申請(qǐng)人應(yīng)當(dāng)查找不一致原因和影響因素，并提供解決方案。
2.4最低檢出限和檢測(cè)上限
2.4.1最低檢出限和檢測(cè)上限的建立
最低檢出限是在滿足檢測(cè)準(zhǔn)確性和精密度的條件下，能夠檢出目標(biāo)基因的人基因組DNA最低濃度。
采用梯度濃度的人基因組DNA樣本進(jìn)行多次重復(fù)檢測(cè)，確定95%檢出率水平下的人基因組DNA最低濃度，即為最低檢出限。
同時(shí)，申請(qǐng)人應(yīng)當(dāng)評(píng)價(jià)可準(zhǔn)確檢出的人基因組DNA濃度上限，即適當(dāng)檢出率水平下的人基因組DNA最高濃度。
申請(qǐng)人可選擇每個(gè)檢測(cè)基因中的代表性等位基因的真實(shí)樣本進(jìn)行最低檢出限及檢測(cè)上限的建立研究。
2.4.2最低檢出限和檢測(cè)上限的驗(yàn)證
選取與建立不同的樣本進(jìn)行驗(yàn)證，應(yīng)納入檢測(cè)范圍內(nèi)的所有等位基因。建議對(duì)最低檢出限和檢測(cè)上限附近濃度水平的樣本進(jìn)行至少20次的重復(fù)檢測(cè)，應(yīng)滿足95%以上檢出率要求。
2.5 分析特異性
2.5.1干擾試驗(yàn)
可通過在臨床樣本中添加干擾物質(zhì)的方式，評(píng)價(jià)添加前后干擾物質(zhì)對(duì)靶基因檢測(cè)的影響。研究用樣本應(yīng)取每個(gè)檢測(cè)基因中具有代表性的等位基因，設(shè)置最低檢出限濃度水平和中高濃度水平樣本。
建議申請(qǐng)人在每種干擾物質(zhì)的潛在最大濃度（“最差條件”）條件下進(jìn)行評(píng)價(jià)，如有干擾，應(yīng)當(dāng)確定不產(chǎn)生干擾的最高濃度。
針對(duì)可能的內(nèi)源和外源性干擾物進(jìn)行干擾試驗(yàn)研究。對(duì)于全血樣本，內(nèi)源性干擾物質(zhì)包括血紅蛋白、甘油三酯、膽紅素、白蛋白；外源性干擾物質(zhì)包括抗凝劑、目標(biāo)人群常用治療藥物等。
2.6.2交叉反應(yīng)
對(duì)與靶基因序列相近或具有同源性、易引起交叉反應(yīng)的其他HLA基因的基因序列進(jìn)行交叉反應(yīng)研究。
2.6包容性研究
對(duì)于低分辨率產(chǎn)品，證明申報(bào)試劑可檢出CWD表中同一血清型不同等位基因的能力，包括重復(fù)性和最低檢出限的驗(yàn)證。
2.7核酸提取/純化性能
在進(jìn)行核酸檢測(cè)之前，建議有核酸提取/純化步驟。對(duì)配合使用的所有核酸提取試劑進(jìn)行提取核酸純度、濃度、提取效率的研究，并與質(zhì)量較好的核酸提取試劑進(jìn)行平行比對(duì)。
若產(chǎn)品適用兩種或以上核酸提取試劑，則每一種核酸提取試劑均需配合檢測(cè)試劑進(jìn)行重復(fù)性、檢出限和抗干擾的驗(yàn)證。
2.8反應(yīng)體系研究
2.8.1樣本采集和處理
請(qǐng)?jiān)斒鰳颖镜牟杉疤幚矸绞?，明確適用的抗凝劑和保存管。
在檢測(cè)試劑的設(shè)計(jì)開發(fā)過程中，申請(qǐng)人明確樣本質(zhì)量接受標(biāo)準(zhǔn)，包括但不限于核酸濃度、純度及完整性等。若不符合要求，應(yīng)當(dāng)重新取樣或擴(kuò)大樣本量再進(jìn)行核酸提取/純化。
2.8.2反應(yīng)體系
依據(jù)產(chǎn)品特性，提供反應(yīng)體系研究資料。包括但不限于核酸提取用的樣本體積、洗脫體積、各反應(yīng)步驟中樣本和試劑的加樣體積、酶濃度、引物/探針濃度、dNTP濃度、陽離子濃度、反應(yīng)條件和質(zhì)控體系設(shè)置等。
不同適用機(jī)型的反應(yīng)條件如果有差異應(yīng)當(dāng)分別詳述，并提交驗(yàn)證資料。
2.8.3 分析系統(tǒng)參數(shù)
2.8.3.1數(shù)據(jù)分析軟件的功能。包括軟件對(duì)儀器產(chǎn)出原始數(shù)據(jù)的導(dǎo)入和識(shí)別，對(duì)高通量測(cè)序方法堿基序列的識(shí)別和拼接，對(duì)SBT方法堿基序列的識(shí)別、對(duì)SSO方法探針熒光信號(hào)的識(shí)別、與參考數(shù)據(jù)庫(kù)的比對(duì)及判斷等位基因的堿基差異和初步分型結(jié)果等功能。
2.8.3.2 SBT方法關(guān)鍵參數(shù)。包括對(duì)測(cè)序峰堿基信號(hào)強(qiáng)度、堿基識(shí)別質(zhì)量、序列開頭引物結(jié)合部位堿基剪切位置的合理性、與參考序列的吻合性及正反向序列的一致性、雙峰判斷比值及背景值的接受標(biāo)準(zhǔn)。
2.8.3.3 SSO方法關(guān)鍵參數(shù)。包括對(duì)微珠最低讀數(shù)、陰性質(zhì)控微珠最高值、探針陰/陽性反應(yīng)判斷正確性等的接受標(biāo)準(zhǔn)。
2.8.3.4 高通量測(cè)序方法關(guān)鍵參數(shù)及其要求
申請(qǐng)人提供整個(gè)檢測(cè)流程的標(biāo)準(zhǔn)操作程序文件（Standard Operating Procedure, SOP)，對(duì)高通量測(cè)序技術(shù)檢測(cè)全過程包括的樣本收集處理、文庫(kù)制備、測(cè)序、數(shù)據(jù)分析、結(jié)果報(bào)告等過程進(jìn)行描述。生物信息學(xué)分析方面描述和記錄數(shù)據(jù)處理及分析，包括識(shí)別、過濾和注釋的所有過程。
文庫(kù)制備要求。申請(qǐng)人應(yīng)當(dāng)建立文庫(kù)構(gòu)建濃度、文庫(kù)片段大小要求，文庫(kù)濃度檢測(cè)方法包括但不限于實(shí)時(shí)熒光定量PCR法；文庫(kù)片段大小檢測(cè)方法包括但不限于毛細(xì)管電泳法等。申請(qǐng)人應(yīng)當(dāng)關(guān)注不同測(cè)序平臺(tái)的性能特點(diǎn)，確保片段長(zhǎng)度分布符合后續(xù)測(cè)序要求。如需要進(jìn)行片段化處理，申請(qǐng)人應(yīng)當(dāng)制定核酸序列片段化操作流程及質(zhì)量控制方案。對(duì)經(jīng)過片段化的核酸短序列的濃度及片段分布等參數(shù)進(jìn)行驗(yàn)證。
上機(jī)測(cè)序時(shí)文庫(kù)終摩爾濃度要求。文庫(kù)定量后需調(diào)整摩爾濃度，以提高測(cè)序質(zhì)量。申請(qǐng)人應(yīng)當(dāng)依據(jù)適用儀器的不同特性，對(duì)上機(jī)測(cè)序文庫(kù)終摩爾濃度進(jìn)行研究。
測(cè)序儀產(chǎn)生數(shù)據(jù)的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)。包括簇密度、簇通過率、Q值、測(cè)序堿基信號(hào)值、數(shù)據(jù)產(chǎn)出量等。
數(shù)據(jù)分析過程的描述。高通量測(cè)序儀常用儀器本地?cái)?shù)據(jù)格式轉(zhuǎn)換工具進(jìn)行堿基識(shí)別，對(duì)下機(jī)原始數(shù)據(jù)，依據(jù)序列上的不同標(biāo)簽進(jìn)行序列拆分，獲得不同樣本的測(cè)試數(shù)據(jù)，完成初級(jí)分析。導(dǎo)入與申報(bào)產(chǎn)品配套數(shù)據(jù)分析軟件后，通過去除質(zhì)量低于Q30的堿基、引物二聚體序列、重復(fù)序列、去除接頭序列（標(biāo)簽序列、引物序列、測(cè)序引物結(jié)合序列）、與現(xiàn)用版本IPD-IMGT/HLA數(shù)據(jù)庫(kù)的參比序列，實(shí)現(xiàn)測(cè)序序列與參比數(shù)據(jù)庫(kù)的比對(duì)，進(jìn)行比對(duì)后數(shù)據(jù)處理，獲得HLA等位基因型的分析結(jié)果，完成數(shù)據(jù)二級(jí)分析。申請(qǐng)人應(yīng)當(dāng)描述測(cè)序產(chǎn)出的數(shù)據(jù)量、數(shù)據(jù)初級(jí)分析和二級(jí)分析的過程。
分析軟件的參數(shù)。數(shù)據(jù)二級(jí)分析時(shí)的設(shè)定參數(shù)，包括但不限于生成分型數(shù)據(jù)最低有效的reads數(shù)目、最大reads數(shù)目、可分析reads最短長(zhǎng)度、可允許插入最大堿基數(shù)、缺失最大堿基數(shù)、錯(cuò)配最大堿基數(shù)、判斷等位基因分型結(jié)果時(shí)任意堿基位置的最低有效reads數(shù)目、堿基可識(shí)別的最低比例、雜合子最低等位基因平衡度等。
HLA分型數(shù)據(jù)的要求。包括Q30＞80%、測(cè)序深度要求（最低測(cè)序深度、平均測(cè)序深度）、測(cè)序均一性、測(cè)序覆蓋度、序列拼接長(zhǎng)度或平均reads長(zhǎng)度、高背景堿基的識(shí)別和判斷、等位基因序列拼接、等位基因平衡等。其中測(cè)序均一性要求reads片段在檢測(cè)區(qū)域均勻分布；測(cè)序覆蓋度要求各基因位點(diǎn)測(cè)序序列100%覆蓋目標(biāo)區(qū)域，尤其是關(guān)鍵外顯子區(qū)域必須完全覆蓋并達(dá)到所要求的測(cè)序深度。對(duì)于高背景堿基的識(shí)別和判斷，其出現(xiàn)的位置和堿基類型固定，常與等位基因有關(guān)，造成結(jié)果分析錯(cuò)誤；申請(qǐng)人需提交影響結(jié)果分析的高背景堿基位置、類型及比例，建立堿基有效識(shí)別及無效識(shí)別的判斷標(biāo)準(zhǔn)，在后續(xù)結(jié)果分析中加以分析。高背景堿基應(yīng)當(dāng)排除移植后送檢樣本因錯(cuò)配移植產(chǎn)生的等位基因嵌合。申請(qǐng)人應(yīng)當(dāng)闡述等位基因序列拼接過程中無法完全拼接的原因及其影響。等位基因平衡指的是等位基因多態(tài)性位置兩個(gè)堿基的比例，區(qū)分純合位點(diǎn)或雜合位點(diǎn)；當(dāng)兩個(gè)堿基比例相近時(shí)判為等位基因平衡，當(dāng)?shù)陀诳山邮艿拈撝禃r(shí)判為等位基因不平衡。申請(qǐng)人應(yīng)當(dāng)提供等位基因不平衡的判斷標(biāo)準(zhǔn)，并在說明書中進(jìn)行提示。
3.陽性判斷值研究
陽性判斷值即為能夠獲得理想的檢測(cè)準(zhǔn)確性的臨界值（Cut-off）。研究樣本為預(yù)期使用人群的真實(shí)樣本，涵蓋中國(guó)人群常見等位基因。樣本來源應(yīng)當(dāng)具有地域和民族多樣性，考慮不同時(shí)間和生理/病理狀。
采用受試者工作特征（ROC）曲線的方式進(jìn)行研究，亦可采用其他科學(xué)合理的方法進(jìn)行陽性判斷值研究。
申請(qǐng)人應(yīng)當(dāng)詳述試驗(yàn)方案，列明所用試劑、儀器、對(duì)比方法、樣本量、樣本入組標(biāo)準(zhǔn)；提交陽性判斷值研究所用樣本的背景信息列表，至少包括民族、性別、年齡、來源、唯一可溯源編號(hào)、臨床診斷信息等）及試驗(yàn)結(jié)果等。
若申報(bào)產(chǎn)品同時(shí)采用人工判讀和軟件判讀兩種判讀模式，請(qǐng)?jiān)敿?xì)描述兩種方式的判讀規(guī)則及研究資料?？紤]到產(chǎn)品特性，人工判讀較為復(fù)雜，請(qǐng)?zhí)峤蝗斯づ凶x準(zhǔn)確性的研究資料，以及人工判讀和軟件判讀的一致性研究資料。
若結(jié)果出現(xiàn)模糊判讀情況，應(yīng)當(dāng)給出解決方案。
4.主要原材料研究資料
該類產(chǎn)品的主要原材料包括引物、探針、酶（連接酶、聚合酶、限制性內(nèi)切酶、DNA聚合酶等）、dNTP、接頭、標(biāo)簽、核酸分離/純化組分、質(zhì)控品、參考品等。申請(qǐng)人可參考《體外診斷試劑注冊(cè)原材料研究注冊(cè)審查指導(dǎo)原則》進(jìn)行主要原材料研究和注冊(cè)申報(bào)資料的準(zhǔn)備。除前述指南的通用要求外，建議申請(qǐng)人額外注意以下內(nèi)容：
4.1引物、探針
詳述引物、探針的設(shè)計(jì)原則，提供引物探針序列、靶基因序列及兩者的對(duì)應(yīng)情況。建議設(shè)計(jì)兩套或多套引物探針以供篩選，針對(duì)待測(cè)位點(diǎn)的檢測(cè)靈敏度和特異性等進(jìn)行評(píng)價(jià)，選擇最佳引物探針組合，并提交詳細(xì)的篩選研究數(shù)據(jù)。同時(shí)針對(duì)引物、探針及檢測(cè)靶序列與公開數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行同源性分析，如有同源序列應(yīng)當(dāng)著重評(píng)價(jià)是否會(huì)有交叉反應(yīng)。
4.2 接頭和標(biāo)簽
申請(qǐng)人應(yīng)當(dāng)明確接頭序列和標(biāo)簽序列，提供接頭和標(biāo)簽的設(shè)計(jì)依據(jù)及研究資料。
4.3質(zhì)控品
陽性質(zhì)控品包括代表性等位基因。同時(shí)設(shè)置不含待測(cè)靶序列的空白質(zhì)控品用于交叉污染的質(zhì)控。
質(zhì)控體系應(yīng)當(dāng)能夠?qū)z測(cè)全過程進(jìn)行有效的質(zhì)量控制，包括試劑及儀器性能、可能的擴(kuò)增反應(yīng)抑制物（管內(nèi)抑制）、交叉污染等因素造成的假陰性或假陽性結(jié)果。質(zhì)控品可采用臨床樣本核酸提取液和細(xì)胞株。質(zhì)控品應(yīng)當(dāng)參與樣本核酸的平行提取。申請(qǐng)人應(yīng)當(dāng)針對(duì)質(zhì)控品原料來源、選擇、制備、定值過程等提供詳細(xì)的研究資料，并對(duì)質(zhì)控品的檢測(cè)結(jié)果做出明確要求。
4.4 內(nèi)標(biāo)
內(nèi)標(biāo)，又稱內(nèi)對(duì)照，可對(duì)管內(nèi)抑制導(dǎo)致的陰性結(jié)果進(jìn)行質(zhì)量控制，應(yīng)當(dāng)與靶核酸一同提取及擴(kuò)增。申請(qǐng)人需對(duì)內(nèi)標(biāo)的引物、探針設(shè)計(jì)和相關(guān)反應(yīng)體系的濃度進(jìn)行研究，同時(shí)明確內(nèi)標(biāo)檢測(cè)結(jié)果的可接受標(biāo)準(zhǔn)。建議科學(xué)設(shè)置內(nèi)標(biāo)，對(duì)待測(cè)樣本的取樣質(zhì)量、試劑的反應(yīng)體系進(jìn)行監(jiān)控。
4.5核酸提取/純化試劑（如有）
提供試劑的主要組成、原理介紹及相關(guān)的篩選及驗(yàn)證資料。
4.6企業(yè)參考品
該類產(chǎn)品的企業(yè)參考品一般包括陽性參考品、陰性參考品、檢出限參考品和精密度參考品。企業(yè)參考品為真實(shí)樣本或其DNA提取液，且應(yīng)當(dāng)根據(jù)產(chǎn)品特點(diǎn)和性能驗(yàn)證的實(shí)際需要進(jìn)行設(shè)置。
提交企業(yè)參考品的原料來源、選擇、制備、濃度及基因亞型確認(rèn)方法或試劑等相關(guān)研究資料。企業(yè)參考品的設(shè)置建議如下：
陽性參考品應(yīng)當(dāng)包含CWD表中的C基因，且設(shè)置不同濃度水平。
陰性參考品建議考慮檢測(cè)特異性的評(píng)價(jià)，納入同源序列交叉反應(yīng)樣本和干擾樣本等。
檢出限參考品包括檢測(cè)范圍內(nèi)的所有等位基因，濃度水平為最低檢出限濃度（95%檢出）。
精密度參考品至少包括包含CWD表中的C基因，濃度水平為最低檢出限濃度。
（三）臨床評(píng)價(jià)資料
臨床試驗(yàn)的開展、方案的制定以及報(bào)告的撰寫等均應(yīng)符合相關(guān)法規(guī)及《體外診斷試劑臨床試驗(yàn)技術(shù)指導(dǎo)原則》（國(guó)家藥品監(jiān)督管理局通告2021年第72號(hào)）的要求，如相關(guān)法規(guī)、文件有更新，臨床試驗(yàn)應(yīng)符合更新后的要求。
1.臨床試驗(yàn)機(jī)構(gòu)
應(yīng)當(dāng)選擇至少3家（含3家）按要求備案的臨床試驗(yàn)機(jī)構(gòu)，按照相關(guān)法規(guī)的要求開展臨床試驗(yàn)。建議申請(qǐng)人根據(jù)產(chǎn)品特點(diǎn)及預(yù)期用途，綜合不同地區(qū)人種和流行病學(xué)背景等因素選擇臨床試驗(yàn)機(jī)構(gòu)。
2.臨床試驗(yàn)方法
如申報(bào)產(chǎn)品已有同類產(chǎn)品上市，建議選擇境內(nèi)已批準(zhǔn)上市的高分辨試劑或?qū)嶒?yàn)室參考方法（如一代測(cè)序、二代測(cè)序及組特異性測(cè)序引物檢測(cè)）進(jìn)行對(duì)比試驗(yàn)研究。
如無已上市產(chǎn)品，應(yīng)當(dāng)選擇實(shí)驗(yàn)室參考方法（如一代測(cè)序、二代測(cè)序及組特異性測(cè)序引物檢測(cè)）進(jìn)行對(duì)比試驗(yàn)研究，并提交相應(yīng)基因位點(diǎn)臨床意義的證據(jù)。
如采用實(shí)驗(yàn)室參考方法，應(yīng)當(dāng)提供臨床試驗(yàn)機(jī)構(gòu)確認(rèn)的參考方法的詳細(xì)資料，如：標(biāo)準(zhǔn)化SOP、方法原理、所需試劑及儀器、參考方法的性能驗(yàn)證、參考方法質(zhì)控、典型的實(shí)驗(yàn)圖譜及數(shù)據(jù)等。
對(duì)于不一致及模棱兩可（多種可能判定）的結(jié)果，應(yīng)當(dāng)結(jié)合其他檢測(cè)方法的結(jié)果及臨床確認(rèn)結(jié)果進(jìn)行分析。
3.受試者選擇和樣本類型
3.1受試者選擇
如預(yù)期用于實(shí)體器官移植，受試者應(yīng)當(dāng)為相應(yīng)器官的移植供受者及潛在供者。供受者均應(yīng)當(dāng)有一定例數(shù)。
如預(yù)期用于造血干細(xì)胞移植，受試者應(yīng)當(dāng)為造血干細(xì)胞移植供受者及潛在供者。供受者均應(yīng)當(dāng)有一定例數(shù)。
3.2 樣本類型
適用的樣本類型一般為靜脈全血。臨床試驗(yàn)應(yīng)當(dāng)納入臨床原始樣本，不應(yīng)直接采用提取的基因組DNA進(jìn)行試驗(yàn)。臨床樣本的采集、處理、保存和提取等應(yīng)當(dāng)同時(shí)滿足申報(bào)產(chǎn)品說明書以及對(duì)比試劑說明書的相關(guān)要求。
4.臨床試驗(yàn)樣本量
樣本量應(yīng)當(dāng)滿足統(tǒng)計(jì)學(xué)要求，建議總樣本量不低于1500例。
臨床試驗(yàn)應(yīng)當(dāng)對(duì)常見基因亞型進(jìn)行充分驗(yàn)證,每種基因亞型均應(yīng)當(dāng)具有一定的陽性例數(shù)。其中頻率達(dá)到0.9%及以上的亞型，應(yīng)當(dāng)分別不少于30例；頻率低于0.9%的常見亞型，應(yīng)當(dāng)分別不少于2例。
此外應(yīng)當(dāng)入組部分確認(rèn)型別及罕見型別樣本，建議不少于100種。
常見、確認(rèn)及罕見型等位基因的定義以最新的中國(guó)常見及確認(rèn)的HLA等位基因表（CWD）為準(zhǔn)。
5.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
應(yīng)當(dāng)對(duì)入組人群進(jìn)行人口學(xué)分析，包括年齡、性別和臨床診斷背景信息等。
應(yīng)當(dāng)統(tǒng)計(jì)臨床試驗(yàn)中各基因亞型納入情況，并參考CWD表對(duì)應(yīng)列出基因頻率。
基因型結(jié)果分析：
應(yīng)當(dāng)以N×N表分別總結(jié)兩種試劑的各基因亞型的定性檢測(cè)結(jié)果，計(jì)算各亞型符合率和各基因座總符合率及95%置信區(qū)間。
血清型結(jié)果分析：
應(yīng)當(dāng)以N×N表分別總結(jié)兩種試劑的各基因座內(nèi)血清型的定性檢測(cè)結(jié)果，計(jì)算各型符合率和總符合率及95%置信區(qū)間。
對(duì)于高分辨率的產(chǎn)品，基因型結(jié)果總符合率95%置信區(qū)間下限應(yīng)當(dāng)不低于99.7%；對(duì)于低分辨率的產(chǎn)品，血清學(xué)結(jié)果總符合率95%置信區(qū)間下限應(yīng)當(dāng)不低于99.7%。
應(yīng)當(dāng)基于產(chǎn)品所包含的用于分型判讀的位點(diǎn)，進(jìn)行結(jié)果統(tǒng)計(jì)。
分析總結(jié)每對(duì)引物/每個(gè)探針的陽性、陰性結(jié)果，確保陰陽性均有一定例數(shù)。如申報(bào)產(chǎn)品采用高通量測(cè)序方法，應(yīng)當(dāng)保證每種捕獲探針?biāo)槍?duì)的型別均應(yīng)當(dāng)有一定例數(shù)的樣本入組。
對(duì)于高通量測(cè)序原理的試劑，應(yīng)當(dāng)對(duì)樣本質(zhì)量和數(shù)據(jù)質(zhì)量進(jìn)行總結(jié)分析，并分層統(tǒng)計(jì)相應(yīng)指標(biāo)在不同水平下的樣本分布。包括有效數(shù)據(jù)量（reads數(shù)）、Q30值、測(cè)序深度(平均深度及最低深度)、靶區(qū)域測(cè)序覆蓋率、均一度（測(cè)序深度達(dá)到20%平均深度的區(qū)域占覆蓋區(qū)域的比例）、序列拼接長(zhǎng)度或平均reads長(zhǎng)度、等位基因平衡比例。其中臨床試驗(yàn)中測(cè)序有效數(shù)據(jù)量應(yīng)當(dāng)滿足說明書要求，且不應(yīng)當(dāng)過度冗余。
不一致的樣本應(yīng)當(dāng)明確其具體的基因型及導(dǎo)致不一致的引物/探針，并有合理的解釋。對(duì)于高通量測(cè)序原理的試劑檢測(cè)不一致的結(jié)果，應(yīng)當(dāng)結(jié)合數(shù)據(jù)質(zhì)量分析解釋。
如涉及軟件判讀，應(yīng)當(dāng)總結(jié)結(jié)果分型表判讀與軟件判讀結(jié)果，計(jì)算其符合率和總符合率及95%置信區(qū)間。
6.倫理學(xué)要求
臨床試驗(yàn)必須符合赫爾辛基宣言的倫理學(xué)準(zhǔn)則。研究者應(yīng)當(dāng)考慮臨床試驗(yàn)用樣本的獲得和試驗(yàn)結(jié)果對(duì)受試者的風(fēng)險(xiǎn)，提請(qǐng)倫理委員會(huì)審查，并獲得倫理委員會(huì)的同意。注冊(cè)申報(bào)時(shí)應(yīng)當(dāng)提交倫理委員會(huì)的審查意見。
7.臨床試驗(yàn)方案
各臨床試驗(yàn)機(jī)構(gòu)應(yīng)當(dāng)執(zhí)行同一方案，且保證在整個(gè)臨床試驗(yàn)過程中遵循預(yù)定的方案，不可隨意改動(dòng)。試驗(yàn)方案應(yīng)當(dāng)確定嚴(yán)格的入選/排除標(biāo)準(zhǔn)，任何已入選的樣本被排除出臨床試驗(yàn)都應(yīng)當(dāng)記錄在案并明確說明原因。在試驗(yàn)操作過程和結(jié)果判定時(shí)應(yīng)當(dāng)采用隨機(jī)盲法以保證試驗(yàn)結(jié)果的客觀性。各臨床試驗(yàn)機(jī)構(gòu)選用的對(duì)比試劑/方法應(yīng)當(dāng)保持一致，以便進(jìn)行合理的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
8.臨床試驗(yàn)報(bào)告撰寫
臨床試驗(yàn)報(bào)告應(yīng)當(dāng)對(duì)試驗(yàn)的整體設(shè)計(jì)及各個(gè)關(guān)鍵點(diǎn)給予清晰、完整的闡述，應(yīng)該對(duì)整個(gè)臨床試驗(yàn)實(shí)施過程、結(jié)果分析、結(jié)論等進(jìn)行條理分明的描述，并應(yīng)當(dāng)包括必要的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)和統(tǒng)計(jì)分析方法，最后得出臨床試驗(yàn)結(jié)論。
對(duì)于基于高通量測(cè)序的試劑，報(bào)告中應(yīng)當(dāng)明確所配套使用的測(cè)序儀、測(cè)序模式、生物信息數(shù)據(jù)分析軟件及參數(shù)、測(cè)序試劑等具體信息。數(shù)據(jù)匯總表中應(yīng)當(dāng)包括初始樣本的核酸濃度、有效數(shù)據(jù)量（reads數(shù)）、Q30值、測(cè)序深度(平均深度及最低深度)、測(cè)序覆蓋率、均一度（測(cè)序深度達(dá)到20%平均深度的區(qū)域占覆蓋區(qū)域的比例）、序列拼接長(zhǎng)度或平均reads長(zhǎng)度、等位基因平衡比例。
（四）產(chǎn)品說明書
說明書編寫應(yīng)當(dāng)符合《體外診斷試劑說明書編寫指導(dǎo)原則（2023年修訂版）》的要求。申報(bào)產(chǎn)品說明書在符合前述指導(dǎo)原則的基礎(chǔ)上，應(yīng)當(dāng)注意：
1.【預(yù)期用途】應(yīng)當(dāng)至少包括以下幾部分內(nèi)容：
1.1本產(chǎn)品用于體外定性檢測(cè)人靜脈外周血樣本中基因組DNA的人類白細(xì)胞抗原Ⅰ類*基因，Ⅱ類*基因的等位基因。
1.2應(yīng)當(dāng)以列表的方式明確申報(bào)產(chǎn)品所能檢測(cè)的HLA基因及具體等位基因，檢測(cè)分辨率（低分辨率/中分辨率/高分辨率）。
具體的臨床用途為：
用于白細(xì)胞抗原低中分辨率分型，為肝/腎等實(shí)體器官（明確具體器官）移植供受者的選擇提供參考。
用于白細(xì)胞抗原高分辨率分型，為造血干細(xì)胞移植供受者的選擇提供參考。亦可為肝/腎等實(shí)體器官（明確具體器官）移植供受者的選擇提供參考。
1.3潛在的供體/受體DNA分型并不是影響患者的臨床決定的唯一測(cè)試；在做出決定移植之前，需要進(jìn)行淋巴細(xì)胞毒性交叉匹配。
1.4明確本產(chǎn)品檢測(cè)結(jié)果僅供臨床參考，臨床醫(yī)生應(yīng)當(dāng)結(jié)合患者病情、療效及其他實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)指標(biāo)等對(duì)本產(chǎn)品的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行綜合判斷。
2.【主要組成成分】
需要但未提供部分請(qǐng)明確配套使用分析軟件的發(fā)布版本。
3.【陽性判斷值】
明確下機(jī)數(shù)據(jù)的可接受質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，如Q30＞80%、測(cè)序深度要求（最低測(cè)序深度、平均測(cè)序深度）、測(cè)序均一性、測(cè)序覆蓋度、序列拼接長(zhǎng)度或平均reads長(zhǎng)度、高背景堿基的識(shí)別和判斷、等位基因序列拼接、等位基因平衡等。
4.【檢驗(yàn)方法的局限性】
明確無法準(zhǔn)確分型的等位基因。
5.說明書增加附件，列表明確可檢測(cè)等位基因。
（六）質(zhì)量管理體系文件
申請(qǐng)人應(yīng)當(dāng)在申請(qǐng)注冊(cè)時(shí)提交與產(chǎn)品研制、生產(chǎn)有關(guān)的質(zhì)量管理體系相關(guān)資料。詳述產(chǎn)品的生產(chǎn)過程，提供生產(chǎn)工藝流程圖。明確申報(bào)產(chǎn)品反應(yīng)及檢測(cè)原理和過程，標(biāo)明主要控制點(diǎn)與項(xiàng)目及主要原材料、采購(gòu)件的來源及質(zhì)量控制方法。
如適用，應(yīng)當(dāng)提供擬核查產(chǎn)品與既往已通過核查產(chǎn)品在生產(chǎn)條件、生產(chǎn)工藝等方面的對(duì)比說明。
三、參考文獻(xiàn)
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[8] 人類白細(xì)胞抗原基因分型技術(shù)平臺(tái)規(guī)范化建設(shè)及臨床應(yīng)用專家共識(shí)[S].
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Einstein. 2011.
附件
背景信息
《Definitions of histocompatibility typing terms》將HLA等位基因的分辨率劃分為高分辨率（High resolution）、低分辨率（Low resolution）和其他分辨率（Other levels of resolution）。在應(yīng)用過程中，為了方便分類，多將其他分辨率稱為“中分辨率”。
高分辨率分型結(jié)果定義為一組等位基因，這些等位基因編碼HLA 蛋白分子區(qū)域（稱為抗原結(jié)合位點(diǎn)）的相同蛋白質(zhì)序列，并排除未表達(dá)為細(xì)胞表面蛋白的等位基因?？乖Y(jié)合位點(diǎn)包括I 類多肽的結(jié)構(gòu)域1 和結(jié)構(gòu)域2，以及II 類多肽鏈的II 類結(jié)構(gòu)域1 和結(jié)構(gòu)域1。
低分辨率指基于DNA 的分型結(jié)果，位于DNA 的命名法中第一個(gè)字段的數(shù)字水平。示例包括：A*01;A*02.如果分辨率對(duì)應(yīng)于血清學(xué)等效結(jié)果，則此分型結(jié)果也應(yīng)稱為低分辨率。
其他分辨率即中分辨率指的是介于高分辨率和低分辨率之間的分辨率水平。一組等位基因的第一個(gè)區(qū)域數(shù)值相同而第二個(gè)區(qū)域是某幾個(gè)等位基因的組合，分辨能力達(dá)不到高分辨水平，但排除了部分第二個(gè)或者其他區(qū)域有區(qū)別的等位基因，如HLA-A*01:01/01:02。
圖1：分辨率劃分
來源：國(guó)家藥監(jiān)局
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