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中和抗體效價(jià)測(cè)定通常使用病毒中和試驗(yàn)（Neutralization Assay）來評(píng)估抗體對(duì)特定病毒的中和能力，常見的方法包括傳統(tǒng)的病毒中和實(shí)驗(yàn)（Plaque Reduction Neutralization Test, PRNT）、基于細(xì)胞病變的中和實(shí)驗(yàn)（Cytopathic Effect Neutralization Assay, CPE assay）以及熒光中和實(shí)驗(yàn)（Fluorescent Neutralization Assay, FNA）。以下是一般的實(shí)驗(yàn)流程，以FNA為例：

 

 

一、實(shí)驗(yàn)材料準(zhǔn)備

 

1.細(xì)胞株：選擇合適的宿主細(xì)胞，接種到48孔板中，培養(yǎng)至匯合度約為60%。

 

2.病毒：準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)使用的病毒株，確定感染劑量（通常使用已知TCID50的病毒）。

 

3.抗體：實(shí)驗(yàn)組為待測(cè)血清或抗體溶液，陰性對(duì)照組為無抗體的培養(yǎng)基或溶液。

 

4.培養(yǎng)基：含有適當(dāng)血清濃度的DMEM或MEM。

 

二、血清/抗體稀釋

 

將待測(cè)血清或抗體按梯度稀釋（如1:10、1:100、1:1000等），每個(gè)稀釋度的抗體分別加入到不同孔中。

 

 

三、病毒與抗體孵育

 

1.取等體積的病毒液和不同稀釋度的抗體混合。

 

2.在37°C條件下孵育1小時(shí)，使抗體與病毒結(jié)合。

 

四、細(xì)胞感染

 

1.將病毒-抗體混合物加入96孔板中的已匯合細(xì)胞。

 

2.在37°C、5% CO?環(huán)境下孵育1小時(shí)，促進(jìn)病毒感染細(xì)胞（可根據(jù)不同病毒與細(xì)胞的特點(diǎn)改變相關(guān)條件）。

 

3.吸掉未結(jié)合的病毒-抗體混合物，加入2%FBS培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)12-48小時(shí)（具體時(shí)間取決于病毒的復(fù)制周期）。

 

五、固定與染色

 

1.培養(yǎng)結(jié)束后，棄去培養(yǎng)基，使用4 %多聚甲醛固定細(xì)胞10-20分鐘。

 

2.用PBS沖洗細(xì)胞3次，每次5分鐘，確保去除殘余固定液。

 

3.加入封閉液（如1% BSA）封閉細(xì)胞表面非特異性結(jié)合位點(diǎn)，室溫孵育30分鐘。

 

六、熒光標(biāo)記

 

1.用熒光標(biāo)記的抗病毒抗體孵育細(xì)胞，室溫下孵育1小時(shí)或4°C孵育過夜。

 

2.孵育后，用PBS沖洗3次，去除未結(jié)合的熒光抗體。

 

七、結(jié)果讀取

 

1.使用熒光顯微鏡或熒光讀板儀檢測(cè)熒光信號(hào)。陽性對(duì)照（無抗體組）顯示病毒感染的熒光信號(hào)，而不同稀釋度的抗體組顯示熒光強(qiáng)度的減少。

 

熒光顯微鏡先被PEDV感染的Vero細(xì)胞，熒光染料為FITC

 

2.根據(jù)熒光強(qiáng)度的降低程度，可以確定抗體對(duì)病毒感染的抑制效果。

 

八、數(shù)據(jù)分析

 

根據(jù)抗體稀釋度與熒光信號(hào)強(qiáng)度之間的關(guān)系，繪制中和曲線，計(jì)算中和抗體效價(jià)。通常使用50%中和效價(jià)（NT50），即能夠中和50%病毒感染的抗體稀釋度。

 

1.數(shù)據(jù)歸一化：

 

首先，將最大病毒感染（沒有抗體的對(duì)照組，0%中和）的熒光信號(hào)作為100%，沒有病毒的空白對(duì)照（0%感染）作為0%。

 

2.使用公式計(jì)算每個(gè)稀釋度下的中和百分比：

 

 

例如，未添加抗體組的熒光信號(hào)是5000，某個(gè)抗體稀釋度下測(cè)得的信號(hào)是3000，則該稀釋度的中和百分比為20%。

 

3.繪制中和曲線

 

橫軸（X軸）表示抗體稀釋度（通常采用對(duì)數(shù)刻度，如1:10、1:100、1:1000等）?？v軸（Y軸）表示中和百分比（從0%到100%）。繪制每個(gè)稀釋度對(duì)應(yīng)的中和百分比，得到一條中和曲線。中和曲線通常呈現(xiàn)S形，低稀釋度時(shí)中和率接近100%，高稀釋度時(shí)中和率接近0%。

 

4.計(jì)算50%中和效價(jià)（NT50）

 

（1）找到50%中和點(diǎn)：

 

根據(jù)繪制的中和曲線，找到中和率為50%時(shí)的點(diǎn)。

 

通過插值法在曲線中找到對(duì)應(yīng)的抗體稀釋度。比如，如果在1:100的稀釋度下中和率為50%，那么NT50就是1:100。

 

（2）使用非線性回歸擬合曲線（此步驟根據(jù)不同實(shí)驗(yàn)需求而定）：

 

為提高精確度，可以使用非線性回歸（如四參數(shù)邏輯回歸，4PL）擬合中和曲線。計(jì)算出50%中和效價(jià)的精確稀釋度值。

 

該方法通過擬合曲線的形式更為準(zhǔn)確地找到NT50。

 

熒光中和實(shí)驗(yàn)的優(yōu)勢(shì)在于其靈敏度高、定量準(zhǔn)確，適用于多種病毒和抗體的中和檢測(cè)，特別是在研究抗病毒藥物或疫苗時(shí)能提供定量數(shù)據(jù)。