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嘉峪檢測網(wǎng) 2024-11-13 20:48
摘 要： 建立高效液相色譜法測定枸杞中對香豆酸的含量。采用Waters Atlantis T3色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）為分離柱，以乙腈-0.1%磷酸（體積比為13∶87）為流動相，流量為1.0 mL/min，進(jìn)樣體積為10 μL，柱溫為30 ℃，檢測波長為310 nm。對香豆酸的質(zhì)量濃度在0.28～13.78 mg/L范圍內(nèi)與色譜峰面積線性關(guān)系良好，線性相關(guān)系數(shù)為0.999 9，方法檢出限為2.03 mg/kg，定量限為6.06 mg/kg。測定結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.62%（n=6），樣品加標(biāo)平均回收率為97.97%。該方法的精密度和準(zhǔn)確度良好，可用于枸杞中對香豆酸含量的測定。
關(guān)鍵詞： 枸杞； 對香豆酸； 高效液相色譜法
枸杞為茄科植物寧夏枸杞Lycium barbarum L.的干燥成熟果實，中華人民共和國藥典(以下簡稱中國藥典)中記載枸杞具有清熱養(yǎng)陰、益腎、平肝等功效，可用于治療肺癆咯血、骨蒸潮熱，頭暈?zāi)垦５劝Y狀[1]。枸杞在我國有著廣泛的種植區(qū)域，主要產(chǎn)地有寧夏、新疆、甘肅、青海、內(nèi)蒙古、河北等[2]。研究發(fā)現(xiàn)枸杞中富含多糖、黃酮、蒽醌類、萜類、氨基酸、色素、脂肪酸、揮發(fā)油、氨基酸、維生素等活性成分[3?5]，具有抗氧化、抗疲勞、抗衰老、保肝明目、神經(jīng)保護(hù)、降血糖、抗骨質(zhì)疏松、抗腫瘤等多種生物學(xué)活性[6?11]。
作為一種藥食兩用的產(chǎn)品，枸杞深受我國人民的喜愛，在我國有著廣泛的應(yīng)用，如采用浸泡或者發(fā)酵等生產(chǎn)工藝，可將枸杞作為主要原料制備功能型保健酒[12]。含有枸杞等多種藥材的保健酒，具有明顯的緩解體力疲勞功能，通過動物實驗確認(rèn)，其緩解體力疲勞的主要成分之一為對香豆酸，通過篩查發(fā)現(xiàn)對香豆酸主要來源于枸杞，因此有必要對枸杞中對香豆酸含量進(jìn)行測定。中國藥典中枸杞的控制指標(biāo)為枸杞多糖和甜菜堿，目前對枸杞的研究主要集中在枸杞多糖等成分上，關(guān)于枸杞中對香豆酸的研究則主要集中在該成分的分離、鑒定及生物活性等方面[13?14]，對其檢測方法報道較少?？抵拘赖萚15]利用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定了寧夏枸杞中香豆素類和苯丙酸類9種成分的含量，其中包括對香豆酸。超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法所使用的儀器價格昂貴，對技術(shù)人員要求高，而高效液相色譜法快速、靈敏、操作簡單、儀器價格也相對較低，是使用較為廣泛的方法。筆者建立了高效液相色譜法測定枸杞中對香豆酸含量的檢測方法，該方法準(zhǔn)確度高、靈敏度高、操作簡單，為枸杞藥材質(zhì)量控制提供了一個新的參考依據(jù)。
1、 實驗部分
1.1 主要儀器與試劑
高效液相色譜儀：1260 Infinity型，配紫外檢測器，美國安捷倫科技有限公司。
電子天平：AB135-S型，感量為0.01 mg，瑞士梅特勒-托利多公司。
恒溫水浴鍋：DZKW-D-6型，北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司。
純水機(jī)：ELGA Option-Q型，法國威立雅環(huán)境集團(tuán)。
甲醇、乙醇：均為分析純，上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。
乙腈、磷酸：均為色譜純，美國賽默飛世爾科技公司。
對香豆酸對照品：純度(質(zhì)量分?jǐn)?shù))為99.7%，批號為112037-202102，中國食品藥品檢定研究院。
枸杞藥材樣品：共54個批次，分別采自寧夏中寧、甘肅玉門、甘肅靖遠(yuǎn)、青海海西州4個不同的產(chǎn)地。
實驗用水為超純水，電阻率不低于18.2 MΩ·cm。
1.2 色譜條件
色譜柱：Waters Atlantis T3柱(250 mm×4.6 mm，5 μm，美國沃特世科技有限公司)；柱溫：30 ℃；流動相：乙腈-0.1%(體積分?jǐn)?shù)，下同)磷酸水溶液(體積比為13∶87)；流量：1.0 mL/min；進(jìn)樣體積：10 μL；檢測波長：310 nm。
1.3 溶液配制
對香豆酸對照品儲備液：275.57 mg/L，精密稱取對香豆酸對照品6.91 mg，置于25 mL容量瓶中，用50% (體積分?jǐn)?shù)，下同)甲醇溶液溶解并定容至標(biāo)線。
對香豆酸對照品溶液：27.56 mg/L，取對香豆酸對照品儲備液2.5 mL于25 mL容量瓶中，用50%甲醇溶液定容至標(biāo)線。
對香豆酸系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：分別精密量取對香豆酸對照品溶液0.1、0.5、1.0、2.0、3.0、5.0 mL，分別置于6只10 mL容量瓶中，加入50%甲醇溶液定容至標(biāo)線，搖勻，配制成對香豆酸的質(zhì)量濃度分別為0.28、0.83、1.38、2.76、5.51、13.78 mg/L的系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。
1.4 樣品處理
精密稱取枸杞藥材粉末約0.5 g于錐形瓶中，加入70% (體積分?jǐn)?shù)，下同)乙醇溶液20 mL，稱定質(zhì)量，加熱回流30 min，取出，冷卻，再稱定質(zhì)量，用70%乙醇溶液補(bǔ)足失去的質(zhì)量，搖勻，用0.22 μm針頭過濾器過濾，得樣品溶液。
1.5 樣品測定
取對香豆酸系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液、樣品溶液，按照1.2色譜條件測定，以色譜峰面積外標(biāo)法計算枸杞藥材中對香豆酸的含量。
2、 結(jié)果與討論
2.1 色譜條件優(yōu)化
2.1.1 檢測波長的選擇
用二極管陣列檢測器將對香豆酸對照品儲備液在210～400 nm波長范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，其光譜圖如圖1所示。由圖1可以看出，對香豆酸在310 nm處有最大吸收，故設(shè)置檢測波長為310 nm。
圖1 對香豆酸吸收光譜圖
Fig. 1 Spectrogram of p-coumaric acid
2.1.2 流動相組成的選擇
對香豆酸在酸性流動相體系下能夠正常出峰，分別考察了乙腈-0.1%磷酸水溶液、乙腈-0.1%(體積分?jǐn)?shù))甲酸水溶液、乙腈-0.1%乙(體積分?jǐn)?shù))酸水溶液3種流動相體系下對香豆酸色譜峰的理論塔板數(shù)和對稱因子，結(jié)果見表1。由表1可知，以乙腈-0.1%磷酸水溶液作為流動相體系時，對香豆酸色譜峰的理論塔板數(shù)最高，色譜峰的對稱性最好，故選擇乙腈-0.1%磷酸水溶液為流動相。
表1 不同流動相體系下對香豆酸色譜峰的理論塔板數(shù)和對稱因子
Tab. 1 Theoretical plate number and symmetry factor of p-coumaric coumaric acid in different mobile phase systems
2.1.3 流動相比例的選擇
以乙腈-0.1%磷酸水溶液為流動相，分別考察乙腈和0.1%磷酸水溶液體積比為20∶80、13∶87、10∶90等度洗脫時，枸杞藥材樣品溶液中對香豆酸的分離效果。結(jié)果表明，當(dāng)乙腈和0.1%磷酸水溶液體積比為13∶87時，枸杞樣品溶液中對香豆酸能夠有效分離，且色譜峰形較好，故選擇乙腈和0.1%磷酸水溶液體積比為13∶87。
2.1.4 色譜柱的選擇
檢測藥材中有效成分的色譜柱大部分以十八烷基硅烷鍵合硅膠(C18)為填料，分別考察了Waters Atlantis T3柱、Agilent ZORBAX SB-Aq C18柱、Sepax HP-C18柱(均為250 mm×4.6 mm，5 μm)，對枸杞藥材中對香豆酸的分離效果。結(jié)果表明，用Sepax HP C18色譜柱分析時，對香豆酸色譜峰形較差，用Agilent ZORBAX SB-Aq C18色譜柱分析時，對香豆酸的分離度較低，用Waters Atlantis T3色譜柱時，對香豆酸的色譜峰形與分離度較好，故選擇Waters Atlantis T3柱。
2.2 樣品提取條件優(yōu)化
枸杞中的對香豆酸存在游離型、游離酯型、可溶性糖苷型、結(jié)合型、不溶性糖苷型5種類型[16?17]，提取枸杞中的對香豆酸時，一般采用一定濃度的乙醇為溶劑，該方法提取出的是游離型對香豆酸，其含量較低；其他結(jié)合態(tài)對香豆酸以酯鍵、糖苷鍵、醚鍵與木素、多糖等連接，形成復(fù)合結(jié)構(gòu)，需要采用酸堿水解等方式提取[18]，這種方式所得對香豆酸含量較高，但枸杞在日常使用過程中，一般很少會用酸堿進(jìn)行提取，因此筆者僅對枸杞中游離型對香豆酸進(jìn)行提取。
2.2.1 樣品提取方式的選擇
分別考察了超聲和回流兩種提取方式，發(fā)現(xiàn)回流提取所得枸杞中對香豆酸的含量高于超聲提取，故選擇回流提取方式。
2.2.2 提取溶劑的選擇
分別考察不同體積分?jǐn)?shù)的甲醇溶液、乙醇溶液作為提取溶劑時枸杞藥材中對香豆酸的測定結(jié)果，結(jié)果見表2。由表2可知，用70%(體積分?jǐn)?shù)，下同)乙醇溶液作為提取溶劑時，所得枸杞藥材中對香豆酸的含量相對較高，故選擇70%乙醇溶液作為提取溶劑。
表2 不同提取溶劑時對香豆酸的測定結(jié)果
Tab. 2 Determination results of p-coumaric acid using different extraction solvents
2.2.3 提取時間的選擇
選擇70%乙醇溶液作為提取溶劑，分別考察不同提取時間時枸杞藥材中對香豆酸的測定結(jié)果，結(jié)果見表3。由表3可知，加熱回流提取30 min，對香豆酸提取率相對較高，故選擇提取時間為30 min。
表3 不同提取時間時對香豆酸的測定結(jié)果
Tab. 3 Determination results of p-coumaric acid at different extraction times
2.3 色譜圖
按照1.2色譜條件，測定對香豆酸對照品溶液及樣品溶液，色譜圖分別如圖2～圖3所示。
圖2 對香豆酸對照品溶液色譜圖
Fig. 2 Chromatogram of coumaric acid reference solution
圖3 樣品溶液色譜圖
Fig. 3 Chromatogram of sample solution
2.4 線性方程和檢出限
在1.2色譜條件下測定對香豆酸系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，結(jié)果見表4。以對香豆酸標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的質(zhì)量濃度(x)為橫坐標(biāo)，對應(yīng)的色譜峰面積(y)為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，計算線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)。得到對香豆酸線性回歸方程為y=76.439 6x-0.635 3，線性相關(guān)系數(shù)為0.999 9，表明對香豆酸的質(zhì)量濃度在0.28～13.78 mg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。
表4 對香豆酸系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液測定結(jié)果
Tab. 4 Determination results of series standard working solutions of p-coumaric acid
將對香豆酸對照品溶液進(jìn)行逐級稀釋，以3倍信噪比所對應(yīng)的目標(biāo)物在樣品中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)作為方法檢出限，以10倍信噪比所對應(yīng)的目標(biāo)物在樣品中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)作為方法定量限。得到方法檢出限為2.03 mg/kg、定量限為6.06 mg/kg。
2.5 精密度試驗
取同一批次枸杞粉末6份，分別按照1.4樣品處理方法制備樣品溶液，在1.2色譜條件下測定，計算對香豆酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)以及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差，結(jié)果見表5。由表5可知，枸杞中對香豆酸平均含量(質(zhì)量分?jǐn)?shù))為113.63 mg/kg，測定結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.62%。表明該方法的精密度良好。
表5 精密度試驗結(jié)果
Tab. 5 Results of precision test
2.6 穩(wěn)定性試驗
取同一枸杞樣品溶液，分別在制備完成后第0、2、4、8、16、24 h進(jìn)樣測定，結(jié)果見表6。由表6可知，對香豆酸色譜峰面積測定結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.83%，表明制備的樣品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。
表6 穩(wěn)定性試驗結(jié)果
Tab. 6 Results of stability test
2.7 樣品加標(biāo)回收試驗
取已知對香豆酸含量的枸杞藥材粉末9份，每份約0.25 g，精密稱定，置于錐形瓶中，分別加入適量對香豆酸對照品溶液，按照1.4樣品處理方法制備樣品溶液，在1.2色譜條件下進(jìn)行測定，結(jié)果見表7。由表7可知，對香豆酸的加標(biāo)平均回收率為97.97%，表明該方法準(zhǔn)確度良好。
表7 加標(biāo)回收試驗結(jié)果
Tab. 7 Results of recoveries test
3、 結(jié)語
建立了高效液相色譜測定枸杞中對香豆酸含量的方法，該方法簡便、準(zhǔn)確、靈敏度高，可以作為枸杞全面質(zhì)量控制和產(chǎn)地區(qū)別的參考方法。
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引用本文： 石豪，毛瓊麗，嚴(yán)玲，等 . 高效液相色譜法測定枸杞中對香豆酸［J］. 化學(xué)分析計量，2024，33（9）：64. (SHI Hao, MAO Qiongli, YAN Ling, et al. Determination of p-coumaric acid in Lycium barbarum by high performance liquid chromatography[J]. Chemical Analysis and Meterage, 2024, 33(9): 64.)
來源：化學(xué)分析計量
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