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細(xì)胞共培養(yǎng)（co-culture）是將兩種或多種不同類型的細(xì)胞同時培養(yǎng)在同一系統(tǒng)中，使它們在共享的環(huán)境中進(jìn)行相互作用。這種技術(shù)用于模擬體內(nèi)的細(xì)胞微環(huán)境，研究不同細(xì)胞之間的相互作用及其對生物學(xué)過程（如信號傳導(dǎo)、細(xì)胞生長、分化等）的影響。

 

一、共培養(yǎng)方式

 

1.直接共培養(yǎng)：

 

定義：將兩種或多種細(xì)胞直接種植在同一培養(yǎng)皿或培養(yǎng)板中。常用于研究細(xì)胞之間的直接接觸及其影響，如免疫細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞的殺傷效應(yīng)。通常用于培養(yǎng)間接與下室細(xì)胞相互作用的細(xì)胞，或某種需要檢測的細(xì)胞類型。上室與下室通過多孔膜隔開，該膜可以允許小分子或分泌因子通過，但不允許細(xì)胞直接接觸。

上室：研究者可以將不同類型的細(xì)胞（如免疫細(xì)胞、上皮細(xì)胞等）放置在上室，以便檢測其分泌的因子對下室中細(xì)胞的影響。

 

下室：下室一般用于培養(yǎng)另一種細(xì)胞類型或?qū)嶒炛兄饕芯康募?xì)胞。這些細(xì)胞可能會受到來自上室的分泌因子或信號的影響，因此可通過分析下室細(xì)胞的反應(yīng)來研究細(xì)胞間的相互作用。

 

優(yōu)點：直接觀察細(xì)胞間的相互作用。

 

缺點：可能導(dǎo)致細(xì)胞混雜，難以分離后續(xù)分析。

 

2.Transwell共培養(yǎng)：

 

定義：使用Transwell系統(tǒng)將不同的細(xì)胞分隔在不同的層次中。上層細(xì)胞放在多孔膜的Transwell插入物中，下層細(xì)胞則在底部培養(yǎng)皿中。廣泛用于研究細(xì)胞間的分泌因子和信號傳導(dǎo)（如腫瘤細(xì)胞與成纖維細(xì)胞之間的相互作用）。

 

 

 

優(yōu)點：通過分泌的信號分子進(jìn)行相互作用，避免了細(xì)胞之間的直接接觸，方便后續(xù)分離和分析。

 

缺點：無法模擬直接接觸的細(xì)胞間相互作用。

 

3.3D共培養(yǎng)：

 

定義：將細(xì)胞種植在三維支架或基質(zhì)中，使其在三維環(huán)境中生長和相互作用。用于更接近體內(nèi)的細(xì)胞微環(huán)境，研究細(xì)胞在三維空間中的生長、分化和相互作用。

 

優(yōu)點：更好地模擬組織中的細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能。

 

缺點：技術(shù)復(fù)雜，成本較高。

 

4.條件培養(yǎng)基共培養(yǎng)：

 

定義：將一種細(xì)胞的培養(yǎng)基收集，經(jīng)過處理后用于另一種細(xì)胞的培養(yǎng)，以研究細(xì)胞分泌的因子對另一種細(xì)胞的影響。

 

優(yōu)點：簡單，易操作。

 

缺點：無法模擬直接接觸或更復(fù)雜的細(xì)胞間相互作用。

 

二、transwell共培養(yǎng)步驟

 

下面我們將以transwell共培養(yǎng)為例，詳細(xì)闡述腫瘤細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的共培養(yǎng)的具體實驗步驟。

 

1.材料準(zhǔn)備：

 

（1）細(xì)胞類型：選擇要共培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞和成纖維細(xì)胞系NIH 3T3。

 

（2）Transwell插入物：通常使用孔徑為0.4 µm的Transwell插入物，以確保細(xì)胞之間只能通過分泌的因子交流，而不會直接接觸。（一般的遷移、侵襲實驗的孔徑為8µm）

 

（3）培養(yǎng)基：選擇合適的培養(yǎng)基，確保兩種細(xì)胞都能生長。提前更換兩種細(xì)胞都能生長的培養(yǎng)基。

 

2.成纖維細(xì)胞接種：

 

（1）取細(xì)胞匯合度70-80%的成纖維細(xì)胞，消化、離心、重懸后計數(shù)

 

（2）將成纖維細(xì)胞接種在Transwell的下層板（通常為6孔板或24孔板），為了觀察成纖維細(xì)胞在腫瘤細(xì)胞細(xì)胞的共同培養(yǎng)下發(fā)生的變化，我們把主要觀察的成纖維細(xì)胞鋪在下室，方便后續(xù)的細(xì)胞收集。（通過收集下室的細(xì)胞，可以直接檢測上室細(xì)胞的分泌物或信號對下室細(xì)胞的影響，比如細(xì)胞的增殖、凋亡、分化等變化。有助于研究細(xì)胞間的相互作用和影響。）

 

（3）鋪板密度根據(jù)細(xì)胞增值情況而定。本次實驗選擇6孔板，每孔鋪4×10?個NIH 3T3細(xì)胞覆蓋底部。

 

（4）培養(yǎng)4小時，等待成纖維細(xì)胞貼壁后鋪腫瘤細(xì)胞。

 

 

 

3.腫瘤細(xì)胞接種：

 

（1）取細(xì)胞匯合度70-80%的腫瘤細(xì)胞消化、離心、重懸后計數(shù)

 

（2）將腫瘤細(xì)胞接種在Transwell的上層隔膜上。在小室上方垂直懸空、勻速滴入腫瘤細(xì)胞懸液

 

（3）鋪板密度密度根據(jù)實驗需要進(jìn)行調(diào)整（通常為5×104到2×105個細(xì)胞/插入物）。

 

4.共培養(yǎng)：

 

將共培養(yǎng)體系放入37°C、5% CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)時間根據(jù)實驗?zāi)康倪x擇。第一次實驗可設(shè)置時間梯度例如24小時、48小時或更長時間。

 

5.實驗終點及分析：

 

共培養(yǎng)后的細(xì)胞可用于細(xì)胞增殖、遷移、侵襲實驗，檢測細(xì)胞形態(tài)、分泌因子的變化，也可以提取RNA、蛋白質(zhì)觀察一系列變化等。

 

三、注意事項

 

1.細(xì)胞比例和密度：不同細(xì)胞系可能需要調(diào)整種植密度，確保實驗數(shù)據(jù)具有可重復(fù)性。

 

2.Transwell的孔徑選擇：一般使用0.4 µm孔徑，防止細(xì)胞穿過隔膜。

 

3.培養(yǎng)時間：根據(jù)實驗的需要設(shè)定共培養(yǎng)時間，短時間的共培養(yǎng)可以評估信號傳遞，長時間共培養(yǎng)可能影響細(xì)胞增殖和分泌功能。

 

通過Transwell共培養(yǎng)方法，可以深入研究細(xì)胞之間的信號傳遞及腫瘤微環(huán)境的復(fù)雜互動。趕快去試一下吧！