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一、實(shí)驗(yàn)原理

流式細(xì)胞術(shù)（Flow Cytometry, FCM）是一種單細(xì)胞定量分析技術(shù)，該技術(shù)通過測定庫爾特電阻、熒光、光散射和光吸收等參數(shù)，可以定量分析細(xì)胞的結(jié)構(gòu)特征（如DNA含量、蛋白、細(xì)胞膜、胞漿或胞核抗原表達(dá)量）和功能特征（如細(xì)胞內(nèi)酶活性、鈣流變化等）等多種重要參數(shù)，進(jìn)行細(xì)胞特征分析與分選。它的核心功能是將混合物中的不同細(xì)胞分離并計(jì)數(shù)，將感興趣的細(xì)胞分選出來，提供分類比例并進(jìn)行進(jìn)一步分析。

二、實(shí)驗(yàn)步驟

（一）樣本制備

1.取樣: 取100μL抗凝血。

2.標(biāo)記：根據(jù)抗體說明書標(biāo)記實(shí)驗(yàn)管?；靹蚝?，室溫避光孵育15分鐘。

3. 溶血：將10×裂紅液用水稀釋10倍，每管加入1mL，振蕩器混勻后室溫避光靜置10分鐘，300g，4°C離心5分鐘。

4. 洗滌：棄去上清，加入1mL 1×PBS洗液，300g離心洗滌5分鐘，洗2-3次。

5. 上機(jī)檢測：棄去上清后加入500μL 1×PBS，混勻懸浮后過濾，避光等待上機(jī)檢測。

（二）儀器操作

1. 打開流式細(xì)胞儀、開啟液流、質(zhì)控。

2. 分選前設(shè)置：共包含兩個(gè)步驟，第一，調(diào)節(jié)合適的液流斷點(diǎn)，待四路窗口形成清晰的5路液流，其中含4個(gè)收集液流，一個(gè)廢液流后，利用“sweetspot”鎖住此斷點(diǎn)；然后利用Accudrop 珠子，調(diào)整 “Drop Delay”時(shí)間，當(dāng)左側(cè)液流接近 100%，而且保持相對穩(wěn)定的范圍的時(shí)間是最佳時(shí)間。

3. 設(shè)置分析條件：完成質(zhì)控后，建立用戶文件夾、當(dāng)日實(shí)驗(yàn)文件夾，根據(jù)細(xì)胞標(biāo)記，選擇所需參數(shù)，根據(jù)各抗原之間生物關(guān)系及實(shí)驗(yàn)主要關(guān)注點(diǎn)，畫好 FSC-SSC及各熒光參數(shù)兩兩相對的散點(diǎn)圖，根據(jù)抗原生物關(guān)系設(shè)置分析門，及群級聯(lián)關(guān)系表。

4. 確定電壓：先上對照管，根據(jù)淋巴細(xì)胞在 FSC-SSC散點(diǎn)圖中的位置，調(diào)整 FSC和SSC兩個(gè)參數(shù)的電壓，保證淋巴、單核及中心粒細(xì)胞呈現(xiàn)在合適的位置，然后設(shè)置P1 門圈住淋巴細(xì)胞；根據(jù)陰性細(xì)胞群位置，調(diào)整好其它熒光參數(shù)的電壓，記錄10000個(gè)細(xì)胞。

5. 分類計(jì)數(shù)：上陽性管，通過分級設(shè)門，完成各抗原之間生物關(guān)系的呈現(xiàn)，及各細(xì)胞分類計(jì)數(shù)情況。

6. 分選設(shè)置：在“sort layout”窗口，設(shè)置收集裝置和純度模式，然后設(shè)置分選門，圈住CD4或CD8 陽性的細(xì)胞，將分選門分別填入左右“sort location field” 框中。

7. 分選：將收集管中分別裝200ul 1XPBS，放入儀器分選倉下面的收集管架上：點(diǎn)“sort”開始分選，此時(shí)“sort location field”框中可見所獲得的CD4或CD8陽性的細(xì)胞數(shù)目；收集到足夠的目的細(xì)胞后，停止分選。

8.細(xì)胞純度檢測：利用上樣針清洗液和水清洗上樣針，直到以水上樣時(shí)，F(xiàn)SC-SSC散點(diǎn)圖中“無點(diǎn)”為止。將分選獲得的CD4陽性細(xì)胞上樣回測，觀察細(xì)胞分選純度；再次清洗上樣針，將分選獲得CD8陽性細(xì)胞上樣回測，觀察細(xì)胞分選純度。

三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果

通過上述步驟，我們可以成功分選并收集到特定的T細(xì)胞群體。

分類結(jié)果分析：外周血CD8+T細(xì)胞在T淋巴細(xì)胞中占比：46.7%，外周血CD4+T細(xì)胞在T淋巴細(xì)胞中占比：36.3%。

分選細(xì)胞純度分析：外周血CD8+T細(xì)胞在T淋巴細(xì)胞中占比：98.3%，不含外周血CD4+T細(xì)胞，表明分選成功。