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嘉峪檢測網(wǎng) 2024-11-15 21:13
摘 要： 建立高效液相色譜-串聯(lián)三重四級桿質(zhì)譜測定西格列汀中亞硝胺類雜質(zhì)Nitroso-STG-19（NTTP）的方法。西格列汀樣品用水溶解，以乙酸乙酯為提取溶劑進(jìn)行超聲提取，離心后取乙酸乙酯層，用Agilent Infinity Lab Poroshell 120 SB-AQ色譜柱（100 mm×3.0 mm，2.7 μm）分離，柱溫為40 ℃，以水（含0.1%甲酸）和甲醇（含0.1%甲酸）為流動相，梯度洗脫，流量為0.6 mL/min。采用大氣壓化學(xué)電離源、正離子掃描、反應(yīng)監(jiān)測模式進(jìn)行檢測。NTTP的質(zhì)量濃度在0.2～3.0 ng/mL范圍內(nèi)與色譜峰面積線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)為0.998，檢出限為0.750 ng/g，定量限為1.500 ng/g。測定結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.7%（n=6），樣品加標(biāo)平均回收率為101.0%。該方法可為控制西格列汀中NTTP的含量提供方法支持。
關(guān)鍵詞： Nitroso-STG-19； 高效液相色譜-串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜； 西格列汀
2022年8月9日，美國食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)官網(wǎng)發(fā)文稱，在一種用于治療Ⅱ型糖尿病(T2DM)的處方藥西格列汀中發(fā)現(xiàn)了亞硝胺類雜質(zhì)Nitroso-STG-19，化學(xué)名為7-亞硝基-3-(三氟甲基)-5，6，7，8-四氫-[1，2，4]三唑并[4，3-a]吡嗪，簡稱NTTP[1]。為避免藥物短缺并確?；颊攉@得充足的藥物供應(yīng)，F(xiàn)DA不會禁用西格列汀，但需要控制用量。NTTP屬于亞硝胺類化合物，是公認(rèn)的具有較高致癌性的化合物，目前雖然還沒有可靠的數(shù)據(jù)來直接評估NTTP致癌的可能性，但FDA用與其密切相關(guān)的亞硝胺化合物的信息來計(jì)算NTTP終生暴露限度。FDA指出，NTTP的臨時(shí)可接受攝入量為每天246.7 ng，終生暴露水平為每天37 ng。臨時(shí)可接受攝入量引發(fā)的癌癥風(fēng)險(xiǎn)水平大于終生暴露水平，因此NTTP的可接受攝入量應(yīng)為每天37 ng。
西格列汀是全球第一個(gè)上市的口服降糖藥，屬于二肽基肽酶-4 (DPP-4)抑制劑，由美國默沙東研制和銷售，該藥是Ⅱ型糖尿病患者必需的獨(dú)家重磅產(chǎn)品[2?3]。西格列汀于2006年10月獲得美國FDA批準(zhǔn)，可單藥或與二甲雙胍、噻唑烷二酮類藥物聯(lián)合使用，用于改善Ⅱ型糖尿病的血糖控制[4?6]。2007年4月，西格列汀與二甲雙胍的復(fù)方制劑在美國獲批上市[3]。西格列汀市場份額大[7?10]，而西格列汀中NTTP含量控制成為藥物質(zhì)量控制的重要任務(wù)。
亞硝胺雜質(zhì)在極低暴露量的情形下具有高度致癌性，常規(guī)的色譜分析方法難以達(dá)到靈敏度要求[11]，而更高靈敏度的質(zhì)譜儀器廣泛用于亞硝胺雜質(zhì)的研究中，以保證亞硝胺類雜質(zhì)能夠準(zhǔn)確有效地檢出[12?15]。袁松等[16]采用電噴霧離子源(ESI)，建立了超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC-MS/MS)法測定磷酸西格列汀中基因毒性雜質(zhì)NTTP，該方法回收率偏高，且需要控制進(jìn)樣盤溫度，方法較為繁瑣。筆者利用大氣壓化學(xué)離子源(APCI)，建立高效液相色譜-串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜法測定西格列汀中NTTP。該方法對目標(biāo)化合物分離效果良好，專屬性強(qiáng)，靈敏度高，可為西格列汀中NTTP的檢測提供參考。
1、 實(shí)驗(yàn)部分
1.1 主要儀器與試劑
液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀：TSQ-Quantis型，美國賽默飛世爾科技公司。
電子天平：(1)QUINTIX125D-1CN/SQP型，感量為0.01 mg；(2)BSA224S-CW型，感量為0.1 mg；德國賽多利斯公司。
超純水機(jī)：FDY8002-UV-E型，青島富勒姆科技有限公司。
旋渦混合器：QT-2A型，上海琪特分析儀器有限公司。
乙酸乙酯、甲酸、甲醇：均為色譜純，上海星可高純?nèi)軇┯邢薰尽?/span>
NTTP對照品：純度(質(zhì)量分?jǐn)?shù))為98.3%，批號為22359174 s-WJ-01，斯坦德科創(chuàng)醫(yī)藥科技(青島)有限公司。
西格列汀片樣品：50 mg/片，批號為STD-005-001，某企業(yè)提供。
實(shí)驗(yàn)用水為超純水，由青島富勒姆超純水機(jī)制得，臨用新制。
1.2 儀器工作條件
1.2.1 色譜條件
色譜柱：Agilent Infinity Lab Poroshell 120 SB-AQ柱(100 mm×3.0 mm，2.7 μm，美國安捷倫科技有限公司)；流動相：A相為0.1% (體積分?jǐn)?shù))甲酸水溶液，B相為0.1% (體積分?jǐn)?shù))甲酸-甲醇溶液，流量為0.6 mL/min；柱溫：40 ℃；進(jìn)樣體積：20 μL；洗脫方式：梯度洗脫，洗脫程序見表1。
表1 梯度洗脫程序
Tab. 1 Gradient elution procedures
1.2.2 質(zhì)譜條件
離子源：大氣壓化學(xué)離子源(APCI)；電離方式：正離子；汽化器溫度260 ℃；離子轉(zhuǎn)移管溫度：260 ℃；檢測方式：反應(yīng)監(jiān)測(SRM)模式；母離子：m/z 222.125；子離子：m/z 192.00 (定量離子)、165.113、177.024；去簇電壓：85 V；碰撞能量：19.49、21.26、10.22 eV。
1.3 溶液配制
空白基質(zhì)溶液：稱取5 g西格列汀片空白輔料于錐形瓶中，準(zhǔn)確加入50 mL水，渦旋60 s，準(zhǔn)確加入50 mL乙酸乙酯，渦旋30 s，超聲10 min，以12 000 r/min轉(zhuǎn)速離心5 min，取乙酸乙酯層即得。
NTTP對照品儲備液：600 ng/mL，精密稱取NTTP對照品適量，用水溶解、稀釋并定容。
NTTP對照品中間溶液：15 ng/mL，精密量取NTTP對照品儲備液適量，用水逐步稀釋并定容。
NTTP對照品校準(zhǔn)溶液：1.5 ng/mL，精密量取NTTP對照品中間溶液適量，置于離心管中，準(zhǔn)確加入2 mL水，渦旋60 s，再加入2 mL空白基質(zhì)溶液，渦旋30 s，超聲10 min，以12 000 r/min轉(zhuǎn)速離心5 min，取空白基質(zhì)溶液層，即得。
NTTP系列校準(zhǔn)溶液：精密量取NTTP對照品中間溶液20、60、200、300、400 μL，按照NTTP對照品校準(zhǔn)溶液配制方法，配制成質(zhì)量濃度分別為0.2、0.4、1.5、2.2、3.0 ng/mL的NTTP系列校準(zhǔn)溶液。
樣品溶液：將固體西格列汀片研碎，精密稱取0.2 g樣品，置于10 mL離心管中，準(zhǔn)確加入2 mL水，渦旋60 s，準(zhǔn)確加入2 mL乙酸乙酯，渦旋30 s，超聲10 min，以12 000 r/min轉(zhuǎn)速離心5 min，取乙酸乙酯層，即為樣品溶液。
1.4 實(shí)驗(yàn)方法
取NTTP對照品校準(zhǔn)溶液和樣品溶液，按照1.2儀器工作條件進(jìn)樣分析，記錄色譜峰面積，按照色譜峰面積外標(biāo)法計(jì)算樣品中的NTTP含量。
2、 結(jié)果與討論
2.1 色譜條件優(yōu)化
2.1.1 色譜柱溫度
稱取樣品適量，精密稱定，加入NTTP對照品中間溶液200 μL，按樣品溶液配制方法制備加標(biāo)樣品溶液。調(diào)整色譜柱溫度分別為35、40、45 ℃，其他儀器條件按1.2設(shè)定，每種溫度下各平行測定2次，計(jì)算測定結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)，結(jié)果見表2。由表2可知，色譜柱溫度在35～45 ℃范圍內(nèi)，測定結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.5%，表明在該溫度范圍內(nèi)色譜柱溫度對測定結(jié)果的影響較小，靈敏度可達(dá)到檢測要求。考慮到儀器自身的波動性，選擇色譜柱溫度為40 ℃。
表2 不同色譜柱溫度時(shí)的測定結(jié)果
Tab. 2 Determination results at different column temperatures
2.1.2 柱流量
稱取樣品適量，精密稱定，加入NTTP對照品中間溶液200 μL，按樣品溶液配制方法制備加標(biāo)樣品溶液。調(diào)整色譜柱流量分別為0.54、0.60、0.66 mL/min，其他儀器條件按1.2設(shè)定，每種流量下各平行測定2次，計(jì)算測定結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差，結(jié)果見表3。由表3可知，色譜柱流量在0.54～0.66 mL/min范圍內(nèi)，測定結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.8%，表明在該流量范圍內(nèi)流量對測定結(jié)果影響較小，靈敏度可達(dá)到檢測要求。考慮到儀器自身的波動性，選擇柱流量為0.60 mL/min。
表3 不同柱流量時(shí)的測定結(jié)果
Tab. 3 Determination results at different column flow rates
2.2 方法專屬性
取空白基質(zhì)溶液、樣品溶液、對照品溶液，按所建方法分別進(jìn)行測定，記錄色譜圖(如圖1所示)。由圖1可以看出，在優(yōu)化的儀器工作條件下，NTTP在4.867 min出峰，空白基質(zhì)溶液、樣品溶液對目標(biāo)峰無干擾，該方法專屬性良好。
圖1 空白基質(zhì)溶液、樣品溶液和NTTP對照品溶液總離子流圖
Fig.1 Total ion chromatograms of blank matrix solution，simple solution，NTTP reference solution
2.3 線性方程和檢出限、定量限
在1.2儀器工作條件下，測定NTTP系列校準(zhǔn)溶液，以目標(biāo)物的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(x)，以對應(yīng)的色譜峰面積為縱坐標(biāo)(y)，繪制校準(zhǔn)曲線。計(jì)算得線性方程為y=1 548.454 2x-86.605 1，相關(guān)系數(shù)為0.998。表明NTTP質(zhì)量濃度在0.2～3.0 ng/mL范圍內(nèi)與色譜峰面積線性關(guān)系良好。
將NTTP對照品校準(zhǔn)溶液逐級稀釋，在1.2儀器工作條件下測定，分別以3倍和10倍信噪比對應(yīng)的質(zhì)量濃度作為方法檢出限和定量限，根據(jù)稱樣質(zhì)量和定容體積換算成樣品中的含量，以質(zhì)量分?jǐn)?shù)(ng/g)表示。計(jì)算得方法檢出限為0.750 ng/g，定量限為1.500 ng/g。
2.4 精密度試驗(yàn)
取同一批樣品，平行稱樣6份，每份稱取約0.2 g，分別加入NTTP對照品中間溶液200 μL，按樣品溶液配制方法制備加標(biāo)樣品溶液，在1.2儀器工作條件下進(jìn)行分析，結(jié)果見表4。由表4可知，6份加標(biāo)樣品溶液測定結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.7%，表明該方法精密度良好。
表4 精密度試驗(yàn)結(jié)果
Tab. 4 Results of precision test
2.5 樣品加標(biāo)回收試驗(yàn)
取同一批樣品，平行稱樣3份，每份稱取約0.2 g，分別加入NTTP對照品中間溶液60、200、300 μL，進(jìn)行低、中、高3種濃度水平的加標(biāo)回收試驗(yàn)，每種加標(biāo)水平取樣3次進(jìn)行分析，結(jié)果見表5。由表5可知，樣品加標(biāo)平均回收率為101.0%，表明該方法準(zhǔn)確度良好，滿足痕量物質(zhì)的檢測要求。
表5 樣品加標(biāo)回收試驗(yàn)結(jié)果
Tab. 5 Results of spiked recycling test
2.6 溶液穩(wěn)定性試驗(yàn)
取NTTP對照品溶液和加標(biāo)樣品溶液，分別于配制完成后第0、6、12、18、36 h取樣測定，計(jì)算色譜峰面積，結(jié)果見表6。由表6可知，NTTP色譜峰面積測定結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為6.2%、6.7%，表明NTTP對照品溶液和加標(biāo)樣品溶液在36 h內(nèi)穩(wěn)定性均良好。
表6 溶液穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果
Tab. 6 Results of solution stability test
3、 結(jié)語
建立了測定西格列汀中基因毒性雜質(zhì)NTTP的高效液相色譜-串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜法。用乙酸乙酯溶劑處理樣品，毒性較小，大幅度降低了對人員和環(huán)境的影響。該方法操作簡單，具有良好的線性、準(zhǔn)確度和精密度，可為控制西格列汀中NTTP的含量提供方法參考。
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引用本文： 劉雪，劉春霞，馮今奮，等 . 高效液相色譜-串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜法測定西格列汀中Nitroso-STG-19［J］. 化學(xué)分析計(jì)量，2024，33（9）：69. (LIU Xue, LIU Chunxia, FENG Jinfen, et al. Determination of Nitroso-STG-19 in Sitagliptin by high performance liquid chromatography-tandem triple quadrupole mass spectrometry[J]. Chemical Analysis and Meterage, 2024, 33(9): 69.)
來源：化學(xué)分析計(jì)量
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