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一、 實驗原理

 

BCA是一種堿性的水溶性復(fù)合物，性質(zhì)穩(wěn)定。在其提供的堿性環(huán)境下，蛋白質(zhì)可以將BCA試劑中的Cu2+還原為Cu+，Cu+繼而與BCA試劑螯合，從而產(chǎn)生藍紫色的絡(luò)合物，在562nm波長處具有強吸收峰，通過測定吸光度，結(jié)合標準曲線即可得知蛋白濃度。BCA法因抗干擾性強、簡便準確，靈敏度高而得到廣泛應(yīng)用，但其也易受溫度、孵育時間的影響。

 

二、 實驗步驟（視試劑盒而定）

 

1) 蛋白標準品配制

室溫完全溶解蛋白標準品,取20µl 5mg/ml BSA蛋白標準溶液用PBS溶液稀釋至100µl,使其終濃度為1.0 mg/ml。

 

2) 配制BSA標準測定溶液

 

3) 工作液配制

將A液與B液按照50:1的比例混合，配成BCA工作液，并混勻。注：此處一定要精準計算待測孔所用工作液的量，如測定4個蛋白樣本，均做3個復(fù)孔，那么加上標曲一共有39孔，每個測定孔均需加入200µl的工作液，那么共需7800µl工作液，則A液：B液=7800:156。

 

4) 加樣

按照第二步所示表格加標準曲線測定孔，將待測樣本以適當體積加入并用PBS補足至20ul（待測樣本加入的量可按照經(jīng)驗值進行估計）。

 

5) 孵育

向各孔中加入200µl的工作液，混勻后37℃孵育30min，亦可室溫放置2h。

6) 測吸光度

測定562nm處的吸光度，記錄數(shù)值，代入標曲計算濃度。

7) 繪制標準曲線計算樣品濃度

a.新建一個Excel表格，將得到的標準品的吸光度按照下方表格排列，并按照試劑說明說輸入相應(yīng)標準品的濃度（這里作者剔除了一個離群值）；

 

 注：此處進行了一個單位的換算，這個可根據(jù)大家的個人習慣來

 

b.選中標準品的吸光度和濃度，點擊“插入”，選擇散點圖；

 

 

 

c.點擊散點圖上的任意一點，右鍵選擇添加趨勢線

 

 

 

 

d.點擊設(shè)置，趨勢線選項選擇“線性”，勾選“顯示公式”和“顯示R平方值”，即可得到標準曲線；

 

 

 

 

        注：橫坐標為吸光度，縱坐標為濃度，R2需要大于0.99方可使用

 

e.計算樣本濃度：代入公式直接計算即可，但要記得樣本稀釋倍數(shù)再給還原回去哦。

 

 

三、 注意事項

 

1)標準品可現(xiàn)配現(xiàn)用，也可配制后在-20℃保存一年，但工作液需要現(xiàn)配現(xiàn)用。

 

2)為保證蛋白濃度測量的準確性，最好做3個復(fù)孔，必要時剔除離群值。

 

3)BCA法測蛋白濃度易受時間及溫度的影響，所以最好每次測定都做標準曲線。

 

4)在制作標曲時，一定要分清橫縱坐標哪個代表濃度哪個代表吸光度，不要搞錯。

 

5)加樣時一定要準確加樣且盡可能避免氣泡產(chǎn)生，以免影響測量（加樣結(jié)束可以用注射器戳破氣泡，并將96孔板放在搖床上混勻片刻，以使樣品與工作液充分接觸）。

 

6)孵育結(jié)束應(yīng)盡快檢測吸光度，并盡可能加快檢測速度，以免帶來誤差。

 

7)一般情況下，樣品的蛋白濃度是比較高的，需要用PBS溶液進行稀釋后測量，稀釋倍數(shù)可根據(jù)經(jīng)驗值進行調(diào)整，保證濃度測量在標準曲線范圍內(nèi)進行。