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小鼠淋巴細(xì)胞是其免疫系統(tǒng)的關(guān)鍵組成部分，主要包括T細(xì)胞、B細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞（NK細(xì)胞）。T細(xì)胞分為輔助性T細(xì)胞（CD4+）和細(xì)胞毒性T細(xì)胞（CD8+），分別在調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)和直接殺傷感染細(xì)胞中發(fā)揮作用。B細(xì)胞負(fù)責(zé)產(chǎn)生抗體和抗原呈遞，而NK細(xì)胞則通過識(shí)別和消滅異常細(xì)胞快速響應(yīng)感染和腫瘤。這些淋巴細(xì)胞廣泛分布在小鼠的脾臟、淋巴結(jié)、胸腺和骨髓等組織中，是免疫學(xué)研究的主要模型，有助于理解人類的免疫機(jī)制。

脾臟作為重要的免疫器官之一，含有豐富的淋巴細(xì)胞，占全身淋巴組織的25%。由于小鼠的血液量較少，從外周血中難以分離出足夠的淋巴細(xì)胞，因此通常需要從小鼠的脾臟中獲取大量的淋巴細(xì)胞。

一、實(shí)驗(yàn)步驟

1、準(zhǔn)備材料和試劑

選擇成年小鼠，確保其具有正常的免疫功能。斷頸處死小鼠，并將小鼠尸體浸泡在75%酒精中進(jìn)行消毒處理。準(zhǔn)備已消毒的眼科剪刀和鑷子，無菌6cm培養(yǎng)皿、冰PBS。

2、處理小鼠脾臟

用剪刀和鑷子取出小鼠的脾臟，置于含有冰冷PBS的培養(yǎng)皿中。將脾臟放在70微米細(xì)胞篩網(wǎng)上。使用5 ml注射器的活塞在篩網(wǎng)上輕輕研磨脾臟，逐步加少量冰PBS，直至脾臟完全被研磨成細(xì)胞懸液。將通過篩網(wǎng)的細(xì)胞懸液收集到15 ml離心管中。

3、離心

1）在一個(gè)15 mL的離心管中，首先加入5 mL的Ficoll分離液。然后將管子傾斜，輕輕地將含有淋巴細(xì)胞的PBS緩慢倒入Ficoll分離液中。此時(shí)，會(huì)觀察到明顯的液體分層現(xiàn)象。

2）接下來，以600 rpm的速度進(jìn)行梯度離心25分鐘，升速和降速均設(shè)置為2。離心結(jié)束后，液體將分成三層。隨后，小心地吸取中間層的液體（其中含有淋巴細(xì)胞和少量紅細(xì)胞），轉(zhuǎn)移到一個(gè)新的15 mL離心管中，并補(bǔ)充PBS，再次以600 rpm離心5分鐘。

3）離心后，棄上清，加入1~2 mL的紅細(xì)胞裂解液，在冰上處理5分鐘。最后，再補(bǔ)充PBS，以600 rpm離心5分鐘。

4）棄上清, 可見白色沉淀，此時(shí)沉淀為總淋巴細(xì)胞。

二、注意事項(xiàng)

1) 使用Ficoll溶液進(jìn)行離心分層后，血液成分會(huì)按密度梯度重新排列。血漿和血小板由于密度較低，會(huì)浮在分層液的上部；PBMC（外周血單個(gè)核細(xì)胞）的密度稍低于Ficoll溶液，因此在界面處形成一層白膜；而紅細(xì)胞和粒細(xì)胞因密度較高，會(huì)沉積在分層液的底部。

離心結(jié)束后，從管底往上依次是紅細(xì)胞、粒細(xì)胞、Ficoll細(xì)胞分離液、淋巴細(xì)胞、血小板和血漿。在提取淋巴細(xì)胞時(shí)，需要小心地移除上層的血漿和血小板，然后再吸取位于界面處的淋巴細(xì)胞層。

2) 梯度離心時(shí)要小心吸取中間層的細(xì)胞懸液，盡量避免吸入上層和下層的液體。

3）加入紅細(xì)胞裂解液后，應(yīng)在冰上處理5分鐘，以提高裂解效果并保持細(xì)胞活性。處理結(jié)束后立即補(bǔ)充PBS并進(jìn)行離心，以去除裂解后的紅細(xì)胞殘?jiān)?/span>

4) 上述所有步驟都必須在無菌環(huán)境中進(jìn)行，使用無菌試劑和耗材。