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前言

 

隨著經濟發(fā)展，肥胖問題日益嚴峻，且肥胖作為一種慢性疾病，還會增加糖尿病、心血管疾病、高血壓以及癌癥等疾病的患病風險。GLP-1類減肥藥具有獨特的作用機制及良好的減重表現(xiàn)，近年來在全球范圍內持續(xù)熱銷，各大公司也在加大研發(fā)投入。研究表明，GLP-1受體（GLP-1R）廣泛分布于全身多個器官或組織，GLP-1受體激動劑（GLP-1RA）不僅具有多重的降糖和減重機制，而且對阿爾茲海默癥、非酒精性脂肪性肝炎等疾病有潛在藥效[1]。本文主要介紹當前GLP-1類藥物的研發(fā)方向及優(yōu)化策略，并針對GLP-1類藥物常見的生物分析挑戰(zhàn)舉例說明其生物分析策略。

 

GLP-1類多肽藥物的技術難點與優(yōu)化策略

 

天然GLP-1過短的半衰期為GLP-1類藥物的研發(fā)帶來了挑戰(zhàn)，目前有許多旨在延長藥物半衰期和增強藥效的策略（如圖1所示）[1]。同時，多肽口服給藥面臨胃腸道組織結構和生理功能構成的障礙，而侵入型的給藥方式會導致更高的成本和更低的患者依從度，研發(fā)GLP-1類藥物的口服制劑能夠讓患者獲益[2]。此外，GLP-1類藥物具有控制血糖、降低體重和積極影響心血管功能等作用，促使人們探索其確切的作用機制[2]。

 

圖1. GLP-1各藥物的半衰期以及延長和增強藥效的策略

 

分子結構優(yōu)化

 

熱門減肥藥司美格魯肽和替爾泊肽均采用了脂肪酸修飾的策略，目的是為了借助脂肪酸與人血清白蛋白（HSA）結合。濃度高且穩(wěn)定的HSA作為藥物在循環(huán)中的儲庫，可以延長藥物半衰期。此外，脂肪酸修飾還可以改變藥物在體內的分布，或者用于開發(fā)肽類藥物的口服給藥途徑[4]。

 

圖2. 人血清白蛋白（HSA）結構圖和脂肪酸結合位點（紅黃標出區(qū)域）[4]

 

創(chuàng)新給藥方式

 

司美格魯肽片借助促滲透劑SNAC的作用，實現(xiàn)了口服給藥方式。SNAC在胃內的作用是升高胃內局部pH值，促進藥物的跨細胞轉運，并且作用充分可逆（圖3）[5]。

 

圖3. 司美格魯肽口服給藥后在胃內的吸收示意圖[5]

 

整體調節(jié)機制

 

研究表明，GLP-1RA能夠作用于胰腺，促進胰島素分泌調節(jié)血糖；作用于大腦，中樞性地抑制食欲降低體重。相對于胰島素等降血糖藥物，GLP-1RA具有整體性調節(jié)的優(yōu)勢，更適合肥胖型糖尿病人（圖4）[6]。此外，肽藥偶聯(lián)GLP-1-MK-801（圖1）通過GLP-1RA介導的大腦NMDA受體拮抗作用，用于肥胖治療[3]。

 

圖4. GLP-1RA整體性調節(jié)與胰島素優(yōu)勢互補

 

GLP-1類多肽藥物開發(fā)中的生物分析挑戰(zhàn)

 

藥代動力學研究在GLP-1類藥物開發(fā)中非常關鍵。例如，在結構優(yōu)化過程中，通過計算半衰期來篩選出長效分子；在給藥方式創(chuàng)新中，通過計算生物利用度來確定最佳制劑處方[4]。胰島素、葡萄糖等生物標記物水平是評價GLP-1類藥物藥效的重要指標[6]。液相色譜-串聯(lián)質譜（LC-MS/MS）是GLP-1類藥物和生物標記物的常用檢測技術，其方法開發(fā)主要面臨三個方面的挑戰(zhàn)：

 

· 干擾大、靈敏度低

 

無創(chuàng)給藥方式研究中，因為多肽難以跨越生理屏障，生物利用度差，體內藥物濃度低，需要提高分析方法的靈敏度，即提高信號和降低背景。

 

· 易結合、回收率低

 

受脂肪酸側鏈、脂肪酸結合位點、肽鏈序列、連接子和間隔子的影響，脂肪酸修飾的GLP-1衍生物與HSA的結合能力差異較大。當結合能力較強時，待測物在樣品處理過程中易出現(xiàn)提取回收率低的問題。

 

· 需要同時檢測的相關生物標記物干擾大

 

GLP-1類藥物能夠調節(jié)胰島素水平，與胰島素藥物聯(lián)用有增效減副的作用。因此胰島素和類似藥物的研究需求增多，要求有足夠分辨能力的分析方法[11]。GLP-1類藥物促進肝臟和肌肉的葡萄糖向糖原轉化，UDP-Glucose是糖原的前體。葡萄糖和UDP-Glucose的特點是基質干擾大和分子極性大，需要抗干擾能力強的分析方法。

 

GLP-1類多肽藥物開發(fā)中的生物分析策略

 

面對上述GLP-1類藥物開發(fā)中的生物分析挑戰(zhàn)，通過改善前處理方法、優(yōu)化液相方法和使用信號高、特異性強的MRM離子對等，可以開發(fā)滿足需求的生物分析方法。下面將結合具體案例介紹其生物分析策略。

 

1、提高分析方法的靈敏度

 

在減肥藥物司美格魯肽皮膚給藥后生物樣品的分析過程中，通過提高信號和降低背景，LLOQ可以優(yōu)化到0.4 ng/mL（圖5）。

 

提高信號

 

· 使用豐度高且干擾小的MRM離子對

 

由于司美格魯肽分子量大，廣譜的同位素峰分布和多電荷會降低質譜信號，MRM模式中碰撞誘導解離（CID）產生大量不同的碎片離子也會稀釋質譜響應[7,8]。為了提高靈敏度，我們建議舍去特異性差、背景高的低質量區(qū)間的碎片離子，優(yōu)先考察特異性強的較大碎片離子。

 

· 濃縮樣品

 

樣品經過前處理方法提取凈化后，體積變大，待測物濃度降低，不利于檢測方法的靈敏度，可以采用吹干復溶等方式濃縮樣品。在此過程中需要優(yōu)化復溶液成分，以得到最佳的靈敏度（表1）。

 

降低殘留

 

我們可以通過換色譜柱、改變液相條件、改變洗針液等方式來降低殘留。例如，司美格魯肽在普通的反相色譜柱Column 1上殘留嚴重，導致分析高濃度樣品后有持續(xù)的殘留，使低濃度樣品檢測不準確。通過調整流動相pH、洗脫梯度和更換色譜柱類型，降低分析物與色譜柱之間相互作用引起的殘留（圖6），可以提高樣品檢測的準確性和檢測靈敏度。

 

圖5. 司美格魯肽Blank（左圖） 和LLOQ （0.4 ng/mL）（右圖）LC-MS/MS圖譜

 

圖6. 更換色譜柱使ULOQ后Blank樣品中的殘留比例降低

 

表1. 司美格魯肽LC-MS/MS方法日內準確度和精密度考查

 

2、改善提取回收率

 

脂肪酸修飾GLP-1衍生物與基質蛋白結合能力較強時，優(yōu)化前處理方法使待測物與基質蛋白分離，可以改善樣品回收率。

 

蛋白沉淀法（PPT）

 

在PPT除蛋白之前，需要通過預處理樣品使待測物從基質蛋白中游離出來，例如，向樣品中加入酸、堿、緩沖液和蛋白變性劑等預處理試劑。常用的沉淀劑包括甲醇或者三氯乙酸溶液，這些沉淀劑能產生比較松散的沉淀物，有利于待測物的游離。

 

固相萃取法（SPE）

 

待測物由于分子極性或處于離子狀態(tài)時會被SPE固定相競爭性地吸附，淋洗后被洗脫液洗脫，而基質中其他成分先一步被淋洗液帶走，從而實現(xiàn)待測物與基質成分的分離（圖7）。脂肪酸修飾的GLP-1衍生物與基質中蛋白結合后體積進一步增大，在SPE固定相中滲透會比較慢，因此需要優(yōu)化洗脫過程[9,10]。當待測物和與蛋白結合能力較強時，需預處理，分離化合物與蛋白復合物后，再進行SPE處理，才能實質性提高回收率。對于非流體基質，需要先預處理得到均一的液體基質，再進行SPE。

 

圖7. PPT和SPE前處理的脂肪酸修飾GLP-1衍生物回收率對比

 

3、GLP-1類藥物相關生物標記物，LC-MS/MS分析策略

 

與GLP-1類多肽藥物相關的生物標記物包括胰島素、胰島素類似物、葡萄糖和葡萄糖代謝物等。LC-MS/MS方法相比其他的生物檢測手段具有選擇性強、分辨率高、抗干擾能力強和基質適用范圍廣等優(yōu)勢。例如，胰島素的檢測有酶聯(lián)免疫法和色譜法，LC-MS/MS屬于色譜法，對胰島素、類似藥物和代謝物等有足夠的分辨能力，與靈敏度較高的酶聯(lián)免疫法互補。

 

合適的內標選擇

 

· 類似物內標

 

胰島素不同的前處理方法如PPT和SPE會產生不一樣的選擇性。例如，基質中一些干擾蛋白與牛胰島素具有相似的疏水性，在前處理過程中同時被提取可能對分析產生干擾。牛胰島素分析使用保留時間接近、但沒有干擾的類似物豬胰島素作為內標來減少基質的影響（圖8）。

 

· 同位素內標

 

穩(wěn)定同位素標記化合物與待測物具有幾乎完全相同的分子結構、化學性質、色譜和質譜行為，作為內標使用時，可以有效地消除電離變化和基質效應對分析的影響，被公認為是葡萄糖及代謝物質譜定量分析的較佳選擇。

 

合適的色譜分析方法

 

· LC-MS/MS方法的選擇性

 

LC-MS/MS方法對胰島素、類似藥物和代謝物具有分辨能力的關鍵是特異性強的MRM離子對。首選完整分析法，跳過酶解或者碎片化，直接在完整層面建立分析方法，使母離子保留分子量差異的特異性。其次，根據(jù)待測胰島素結構，選擇具有特異性的碎片離子組成MRM離子對，能夠有效地減少干擾（表2）。

 

圖8. LC-MS/MS分析待測物牛胰島素和內標豬胰島素圖譜

 

表2. 胰島素MRM離子對

化合物	類型	MRM
牛胰島素	待測物	956/1114
豬胰島素	內標	964/1130

 

· 柱色譜分離

 

葡萄糖和UDP-Glucose由于極性大，在普通反相色譜上難以保留。親水作用色譜（HILIC）采用高乙腈低水含量的流動相與極性固定相的組合，按親水性由小到大的順序梯度洗脫分析物，可以成功保留葡萄糖。對于二磷酸化合物UDP-Glucose，流動相中添加的離子對試劑的疏水部分與色譜柱固定相發(fā)生作用吸附在柱床上，使固定相具有一定的離子交換能力，從而增強帶相反電荷的待測物的保留（圖9）。這個動態(tài)平衡的過程被稱為動態(tài)離子交換模式。

 

圖9. LC-MS/MS分析待測物葡萄糖（左圖）和UDP-Glucose（右圖）

 

綜上，GLP-1類藥物具有多肽常見的非特異性吸附、生物基質中穩(wěn)定性差等生物分析難點，更多的分析挑戰(zhàn)來自于藥物研發(fā)創(chuàng)新帶來的殘留、提取回收率和方法靈敏度問題。其相關的生物標記物的生物分析也面臨著多重挑戰(zhàn)。通過采用不同的生物分析策略，可以解決上述問題，助力GLP-1類藥物的生物分析。

 

 結語 

 

隨著全球肥胖水位線的高漲，減重版司美格魯肽和替爾泊肽等GLP-1類藥物獲得了巨大成功，引領了GLP-1RA適應癥和肥胖適應癥等方向的藥物研發(fā)熱潮?；谝合喾蛛x、質譜檢測和樣品前處理的生物分析方法，具有高選擇性、較高靈敏度和較寬的線性范圍，廣泛適用于生物樣品中GLP-1類藥物的定量分析。GLP-1類藥物未來研發(fā)的方向有抗體結合和Fc融合GLP-1以及肽藥偶聯(lián)等形式。藥明康德藥性評價部（DMPK）配備了LC-MS/MS和LC-HRMS等分析平臺，具備豐富的實戰(zhàn)經驗，可滿足各種形式大小分子的GLP-1類藥物的分析需求，助力醫(yī)藥公司開發(fā)更有前景的減肥藥。

 

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