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親脂性和微粒體蛋白孵育濃度是預(yù)估化合物與微粒體非特異性結(jié)合程度的決定因素。Austin和Hallifax、Houston等分別于2002年及2006年提出了兩種預(yù)測(cè)方程用于評(píng)估孵育過(guò)程中化合物在微粒體中的游離分?jǐn)?shù)（fraction unbound in the incubation, fuinc）。統(tǒng)計(jì)顯示，針對(duì)不同親脂性的化合物和微粒體蛋白濃度，僅使用這些預(yù)測(cè)工具來(lái)評(píng)估fuinc有一定的局限性，準(zhǔn)確度較差，必要時(shí)應(yīng)當(dāng)通過(guò)實(shí)驗(yàn)來(lái)測(cè)定fuinc。那么應(yīng)當(dāng)如何選擇合適的途徑來(lái)準(zhǔn)確獲得fuinc呢？

 

我們的回答如下：

 

對(duì)于低親脂性（logP/D<2.5）化合物，可以使用Austin或Hallifax&Houston的預(yù)測(cè)方程，能夠得到準(zhǔn)確度較高的fuinc。

 

對(duì)于高親脂性（logP/D>5）化合物，兩種預(yù)測(cè)方程均無(wú)法準(zhǔn)確預(yù)測(cè)fuinc，必須通過(guò)實(shí)驗(yàn)來(lái)測(cè)定。

 

對(duì)于中等親脂性（logP/D 2.5~5）化合物，兩種預(yù)測(cè)方程得到的結(jié)果有顯著差異，預(yù)測(cè)準(zhǔn)確度一般，建議通過(guò)實(shí)驗(yàn)來(lái)測(cè)定fuinc。

 

如今，利用動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及體外實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)，人們已經(jīng)建立了多種預(yù)測(cè)人體藥代動(dòng)力學(xué)和藥效動(dòng)力學(xué)的模型。其中化合物在微粒體孵育體系中的蛋白結(jié)合率是體外-體內(nèi)外推（In Vitro-In Vivo Extrapolation，IVIVE）的一個(gè)重要參數(shù)。化合物與微粒體的非特異性結(jié)合可能會(huì)導(dǎo)致體內(nèi)清除率被低估，或者在評(píng)價(jià)藥物相互作用時(shí)出現(xiàn)IC50或Ki值被高估等后果。因此準(zhǔn)確評(píng)估化合物與微粒體蛋白結(jié)合的程度十分重要，并且具有一定挑戰(zhàn)性。

 

在藥物研發(fā)早期，通常使用計(jì)算機(jī)模型預(yù)測(cè)的方法來(lái)進(jìn)行一些成藥性質(zhì)的評(píng)價(jià)。用于評(píng)估fuinc的Austin預(yù)測(cè)方程[1]和Hallifax&Houston預(yù)測(cè)方程[2]都是基于微粒體蛋白濃度以及所研究化合物的親脂性所提出的，那么它們的準(zhǔn)確度怎么樣呢？什么情況下有必要通過(guò)實(shí)驗(yàn)來(lái)確證化合物的fuinc？

 

表1. Austin預(yù)測(cè)方程和Hallifax&Houston預(yù)測(cè)方程

注：aC指微粒體蛋白濃度。

 

b在應(yīng)用上述預(yù)測(cè)方程時(shí)，對(duì)于堿性及中性化合物使用分配系數(shù)logP來(lái)計(jì)算，酸性化合物使用分布系數(shù)logD來(lái)計(jì)算。

 

英國(guó)曼徹斯特大學(xué)曾匯總了127個(gè)不同親脂性化合物的數(shù)據(jù)，以評(píng)估化合物親脂性和微粒體蛋白濃度對(duì)于fuinc預(yù)測(cè)準(zhǔn)確度的影響[3]。由于藥物代謝和抑制類實(shí)驗(yàn)廣泛應(yīng)用0.1~1.0 mg/mL的微粒體蛋白濃度，因此選定了這一濃度范圍。該統(tǒng)計(jì)匯總了平衡透析法測(cè)定的fuinc或文獻(xiàn)報(bào)道值（微粒體蛋白濃度：0.1、0.5和1.0mg/mL），并與上述兩種方程的預(yù)測(cè)值進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)及比較。

 

使用Austin和Hallifax&Houston預(yù)測(cè)方程在0.05~2mg/mL微粒體蛋白濃度范圍內(nèi)生成的模擬數(shù)據(jù)集（圖1）顯示，化合物的親脂性對(duì)于預(yù)測(cè)fuinc的影響大于微粒體蛋白濃度的影響。

 

圖1. 在親脂性（logP/D 0~8）和微粒體蛋白濃度（C 0.05-2mg/mL）范圍內(nèi)，Hallifax&Houston和Austin方程fuinc預(yù)測(cè)值的比值[3]。

 

如下表2所示，在微粒體蛋白濃度較低（0.1mg/mL）時(shí)，所統(tǒng)計(jì)的127個(gè)化合物中，Austin預(yù)測(cè)方程和Hallifax&Houston預(yù)測(cè)方程的fuinc預(yù)測(cè)值與實(shí)驗(yàn)值差異在1.5倍以內(nèi)的化合物均占比80%以上，僅有約8%的預(yù)測(cè)值與實(shí)驗(yàn)值差異超過(guò)2倍。說(shuō)明在此微粒體蛋白濃度下，這兩種方程均能夠準(zhǔn)確地預(yù)測(cè)fuinc。而隨著微粒體蛋白濃度的增加，預(yù)測(cè)值的準(zhǔn)確度有所下降。當(dāng)微粒體蛋白濃度提高到0.5mg/mL時(shí)，預(yù)測(cè)值與實(shí)驗(yàn)值差異超過(guò)2倍的化合物占比增長(zhǎng)至約16%。當(dāng)微粒體濃度提高到1.0mg/mL時(shí)，這一比例增長(zhǎng)至22%以上。

 

表2. 在不同微粒體濃度下，使用Austin方程和Hallifax&Houston方程預(yù)測(cè)不同親脂性化合物的fuinc的準(zhǔn)確度統(tǒng)計(jì)[3]

總體而言，相較于化合物的親脂性，微粒體蛋白濃度對(duì)預(yù)測(cè)fuinc影響較小，但在較高的微粒體濃度下，該影響仍不可忽視。

 

對(duì)于低親脂性（logP/D<2.5）化合物，可以使用Austin或Hallifax&Houston預(yù)測(cè)方程，能夠得到準(zhǔn)確度較高的fuinc。

 

圖2. 127個(gè)化合物的fuinc預(yù)測(cè)值/實(shí)驗(yàn)值比值（predicted/observed fuinc ratio）與親脂性（logP/D）的統(tǒng)計(jì)[3]。

 

微粒體蛋白濃度分別為0.1mg/mL（A）和1.0mg/mL（B）。

 

□為Austin方程預(yù)測(cè)值?！鰹镠allifax&Houston方程預(yù)測(cè)值。

 

如圖2所示，對(duì)于選定的62個(gè)親脂性較低（logP/D<2.5）的化合物，在0.1mg/mL和1.0mg/mL微粒體蛋白濃度下Austin或Hallifax&Houston預(yù)測(cè)方程均能準(zhǔn)確地預(yù)測(cè)fuinc。除兩個(gè)化合物的預(yù)測(cè)值均高估50%以外，其余化合物的預(yù)測(cè)值與實(shí)驗(yàn)值差異均在2倍范圍內(nèi)。因此對(duì)于親脂性低（logP/D<2.5）的化合物，尤其是在微粒體蛋白濃度較低時(shí)，在高通量篩選階段，可以使用Austin或Hallifax&Houston兩種預(yù)測(cè)方程，快速、準(zhǔn)確地得到fuinc。

 

對(duì)于高親脂性（logP/D>5）化合物，兩種預(yù)測(cè)方程均無(wú)法準(zhǔn)確預(yù)測(cè)fuinc，必須通過(guò)實(shí)驗(yàn)來(lái)測(cè)定。

 

對(duì)于選定的14個(gè)高親脂性（logP/D>5）化合物，在0.1mg/mL和1.0mg/mL微粒體蛋白濃度下，兩種方程均無(wú)法準(zhǔn)確預(yù)測(cè)fuinc。在高微粒體蛋白濃度（1.0mg/mL），Austin和Hallifax&Houston方程將fuinc平均低估了159%和131%（表1，圖2）。另外由于親脂性logP/D>7化合物成藥性較低，因此該范圍內(nèi)的化合物并未納入這一統(tǒng)計(jì)中，但可以預(yù)期到針對(duì)該類化合物，預(yù)測(cè)方程的準(zhǔn)確度較低。

 

對(duì)于中等親脂性（logP/D 2.5~5）化合物，兩種預(yù)測(cè)方程得到的結(jié)果有顯著差異，預(yù)測(cè)準(zhǔn)確度一般，建議通過(guò)實(shí)驗(yàn)來(lái)測(cè)定fuinc。

 

對(duì)于選定的logP/D在2.5~5范圍內(nèi)的51個(gè)化合物，兩種方程預(yù)測(cè)的結(jié)果存在顯著性差異，并且隨著微粒體蛋白濃度的增加，預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確度變得非常低（圖2）。在0.1和1.0mg/mL微粒體蛋白濃度下，Hallifax&Houston方程預(yù)測(cè)值與實(shí)驗(yàn)值差異在1.5倍內(nèi)的占比分別為82.4%和52.9%，差異超過(guò)2倍的占比分別為7.8%和39.2%。而Austin方程預(yù)測(cè)值與實(shí)驗(yàn)值差異在1.5倍內(nèi)的占比則分別為72.5%和21.6%，差異超過(guò)2倍的占比9.8%和54.9%。在0.1、0.5和1.0mg/mL微粒體蛋白濃度下，兩種預(yù)測(cè)方程預(yù)測(cè)值與實(shí)驗(yàn)值差異超過(guò)2倍的平均占比約28.8%，預(yù)測(cè)準(zhǔn)確度一般。

 

雖然文獻(xiàn)中指出當(dāng)微粒體蛋白濃度高于0.1mg/mL時(shí)，對(duì)于logP/D≥3的化合物通過(guò)實(shí)驗(yàn)測(cè)定fuinc[3]，但我們?nèi)越ㄗh，無(wú)論微粒體蛋白濃度高低，對(duì)于logP/D 2.5~5范圍內(nèi)的化合物也都采取實(shí)驗(yàn)手段，以便能夠獲得準(zhǔn)確的結(jié)果。

 

結(jié) 語(yǔ)

 

為了避免化合物與微粒體蛋白的非特異性結(jié)合對(duì)成藥性評(píng)價(jià)產(chǎn)生影響，通常選擇低濃度的微粒體蛋白進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，特別是對(duì)于具有高酶活性的重組酶。然而，在某些條件下，例如研究Ⅱ相代謝反應(yīng)或腸道代謝時(shí)，仍然需要使用較高濃度的微粒體。值得注意的是，即使是在較低的微粒體蛋白濃度下，高親脂性化合物也可能顯示出較高的微粒體蛋白結(jié)合率。因此使用預(yù)測(cè)方程具有一定的局限性，在藥物研發(fā)后期，建議通過(guò)實(shí)驗(yàn)來(lái)準(zhǔn)確測(cè)定fuinc。

 

綜上所述，藥物研發(fā)早期，使用計(jì)算機(jī)模型來(lái)預(yù)測(cè)化合物與微粒體的非特異性結(jié)合提高了篩選速度。然而針對(duì)不同親脂性質(zhì)的化合物或微粒體蛋白濃度條件，僅通過(guò)預(yù)測(cè)方法存在一定的局限性，實(shí)驗(yàn)手段是必不可少的，需要根據(jù)化合物性質(zhì)及研究目的，選擇合適的途徑去評(píng)估fuinc，以保證結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。

 

參考文獻(xiàn)：

 

[1] Austin RP, Barton P, Cockroft SL, Wenlock MC, and Riley RJ. The influence of nonspecific microsomal binding on apparent intrinsic clearance, and its prediction from physicochemical properties. Drug Metab Dispos. 2002 30: 1497–1503.

 

[2] Hallifax D and Houston JB. Binding of drugs to hepatic microsomes: comment and assessment of current prediction methodology with recommendation for improvement. Drug Metab Dispos. 2006 34: 724–726.

 

[3] Gertz M, Kilford PJ, Houston JB, Galetin A. Drug lipophilicity and microsomal protein concentration as determinants in the prediction of the fraction unbound in microsomal incubations. Drug Metab Dispos. 2008 36(3):535-542.