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在細(xì)胞研究中，通常需要對(duì)細(xì)胞的各個(gè)組份加以探究。其中，對(duì)細(xì)胞核蛋白和細(xì)胞漿蛋白進(jìn)行分離，既能夠?yàn)檠芯康鞍自诩?xì)胞內(nèi)的位置提供幫助，也常常使得分離得到的核蛋白在轉(zhuǎn)錄調(diào)控研究中發(fā)揮作用。

以勻漿器研磨法提取貼壁細(xì)胞核蛋白為例：

一、準(zhǔn)備試劑

1、臺(tái)盼藍(lán)染液：取臺(tái)盼藍(lán)粉劑，將其溶解在10mL的雙蒸水當(dāng)中配制成質(zhì)量體積比為4%（4%w/v）的臺(tái)盼藍(lán)母液。在使用時(shí)，利用PBS緩沖液將母液稀釋10倍，使其濃度達(dá)到0.4%，之后再與細(xì)胞懸液混合均勻。

2、BufferA：包含10mmol/L的HEPES（在4℃下pH值為7.9）、1.5mmol/L的氯化鎂、10 mmol/L的氯化鉀、0.5mmol/L的二硫蘇糖醇（DTT）。若擔(dān)心漿蛋白降解會(huì)對(duì)核蛋白產(chǎn)生影響，可以添加1mmol/L的苯甲基磺酰氟（PMSF）。

3、BufferB：含有20mmol/L的HEPES（pH值為7.9）、體積分?jǐn)?shù)為25%的甘油、0.42mol/L的氯化鈉、1.5mmol/L的氯化鎂、0.2mmol/L的乙二胺四乙酸（EDTA）、0.5mmol/L的苯甲基磺酰氟（PMSF）、0.5mmol/L的二硫蘇糖醇（DTT）。

二、實(shí)驗(yàn)步驟

1、使用胰酶將貼壁細(xì)胞消化下來，把這些細(xì)胞收集到1.5mL EP管中。4℃以300g的離心力離心5min。離心完成后，用PBS緩沖液對(duì)細(xì)胞進(jìn)行洗滌(2次)。

2、棄上清，加入體積為細(xì)胞沉淀5倍的預(yù)冷Buffer A（每20μL的細(xì)胞沉淀加入100μL的Buffer A），之后輕輕吹打，使細(xì)胞在Buffer A中重新懸浮起來。

3、將上述細(xì)胞懸浮液在冰上放置10min，隨后再次在4℃條件下，以300g的離心力離心5min。離心結(jié)束后，加入體積為其25倍的預(yù)冷Buffer A，并通過吹打操作讓細(xì)胞重新懸浮。

4、把經(jīng)過上述處理后的細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移勻漿器中，準(zhǔn)備進(jìn)行勻漿操作。

5、在勻漿過程中，取出少量的細(xì)胞懸液，與等體積的0.4%臺(tái)盼藍(lán)染液混合均勻，接著在顯微鏡下觀察細(xì)胞的破膜情況。如果觀察到大部分細(xì)胞都被染成了藍(lán)色，就停止勻漿操作；要是大部分細(xì)胞未被染成藍(lán)色，則繼續(xù)進(jìn)行勻漿。

6、當(dāng)大部分細(xì)胞的細(xì)胞膜被破壞后，將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至Eppendorf管中，然后在4℃環(huán)境下，以25000g的離心力離心20min。

7、離心完成后，此時(shí)上清液中包含的是細(xì)胞裂解物中的胞漿成分，而沉淀部分則是核蛋白。

8、收集離心后的沉淀，向其中加入與沉淀等體積的預(yù)冷Buffer B，然后輕輕地吹打，使沉淀呈現(xiàn)懸浮狀態(tài)。接著將懸浮液轉(zhuǎn)移到干凈的組織勻漿器中，以均勻的力度進(jìn)行30次勻漿操作。

9、把經(jīng)過勻漿的懸浮液轉(zhuǎn)移到Eppendorf管中，放在冰上的低速搖床上振蕩45min。

10、在4℃條件下，以25000g的離心力離心30min，收集得到的上清液即為細(xì)胞核蛋白

11、提取核蛋白后，可使用一些核蛋白（如H3蛋白、Lamin蛋白）作為對(duì)照蛋白，進(jìn)行WB驗(yàn)證。

內(nèi)源性circ-sirt1的敲除增強(qiáng)了TNF-α誘導(dǎo)的NF-κBp65核轉(zhuǎn)位

三、注意事項(xiàng)

1、全部步驟均需于冰上操作。

2、第七步操作切勿觸碰沉淀，可于沉淀上方留存極少量上清液，該上清液即為抽提所得的細(xì)胞漿蛋，不然會(huì)造成細(xì)胞漿蛋白的污染狀況。